iTRAQ定量蛋白质组学..

iTRAQ实验结果示例
1: 提取各组蛋白质、定量并用胰酶 酶切；
2. 各组肽段分别用4种iTRAQ试剂标 记 (例如对照组用iTRAQ 117标记， 其他3个实验组分别用iTRAQ 114, 115, 116标记)；
3. 标记好的各组样本等量混合，液 相分离和质谱分析. 4: 不同样本中蛋白质的差异表达可 通过二级质谱中iTRAQ试剂的峰面积 确定，如图所示：与对照组相比， 该蛋白在3个处理组(114-116)中的 相对表达量较高。 5. 根据该肽段的二级质谱峰图，
（4）0.1%TFA 冲洗柱子3~5次 （5）用50%乙腈 0.1%TFA 400μL洗脱下样品
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iTRAQ实验流程
iTRAQ实验流程。 1：收集不同组别的样本并分别 提取蛋白质；
2：蛋白质经过还原，封闭后用 胰蛋白酶酶切； 3：各组样本的肽段混合物分别 用不同的iTRAQ试剂标记； 4：等量混合各样本中的标记肽 段； 5：MS/MS质谱检测及分析。
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结合数据库检索，得到蛋白的定 性信息。 辉骏生物www.fitgene.com
iTRAQ详细实验步骤—ABI试剂盒
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iTRAQ详细实验步骤
• 1：蛋白质提取
可以选择提取蛋白质常用的各种溶液，裂解液里最好不要包括下面试 剂，因为这些试剂会干扰iTRAQ试剂的标记反应。
iTRAQ定量蛋白质组学
广州辉骏生物科技有限公司
主要内容
• iTRAQ技术简介 • iTRAQ试剂标记原理 • iTRAQ技术优势
• iTRAQ实验流程
• i来自百度文库RAQ实验结果示例 • iTRAQ实验详细步骤
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iTRAQ技术简介
iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同重标签标记的相对和绝对定量 (isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术。 iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连接 的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同 样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在一级质谱中，不同来源的相同肽段表现为一个峰； 在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子 表现为不同质荷比(114～121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可 以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果 结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类（图1）。
iTRAQ技术优势
灵敏度高：可检测出低丰度蛋白； 分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、 难溶性蛋白等； 适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋 白和胞外蛋白等。 高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式 或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析； 结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水 平、分子量和丰富的结构信息； 自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
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图1 iTRAQ技术原理图
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iTRAQ试剂标记原理
iTRAQ试剂包括3部分： 1. 报告部分 2. 肽反应部分 3. 平衡部位(图2)
图2 ITRAQ试剂结构 报告部分共有8种：质量数分别为114~121Da，因此iTRAQ最多可同时 标记8组样品（客户可按需选择标记个数）。 肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部 分和平衡部位标记到肽段上，几乎可以标记所有蛋白质。 平衡部分：质量数分别为31~24Da，与报告部分相互配合，保证 iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比。 辉骏生物www.fitgene.com
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iTRAQ详细实验步骤
3：酶切，标记
(1) 每组样本（各100μg）分别加入-20℃预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1）， 颠倒混匀，-20℃沉淀30min~4h（根据样品所需沉淀量选择时间，一般开始时可 选1小时）； 12000rpm 离心15分钟，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液dissolution buffer（ 20μL） 和1% SDS(1μL)充分混悬溶解样品； 加入还原试剂2μL，混匀，60 ℃反应1h； 加入半胱氨酸封闭试剂（cystine blocking regent）1μL,室温处理10分钟； 按照酶：蛋白质=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解过夜（16h）； 113,114,115,116,117,118,119,121各管标记试剂中加入50μL异丙醇(试剂盒中 自带），混匀，分别加入各管样品中，室温反应1h，之后各加入3倍体积的水，使 标记试剂分解。标记和样品对应关系如下:4R—117,未知—118，BOO6— 119,11R—121； 合并各管标记好的样品，真空冷冻干燥。
(2) (3) (4) (5) (6)
(7)
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iTRAQ详细实验步骤
4： 除盐，此步操作是将标记过程中的标记试剂和相关buffer的盐 除去，以便于后续分析。 （1）100%乙腈冲洗柱子3次 （2）0.1%TFA(水溶),冲洗柱子三次
（3）用400uL 0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上
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iTRAQ详细实验步骤
2：蛋白质定量 (1) 可以采用Bradford方法及其他方法定量初步 (2) 定量取各组样本的蛋白质进行SDS-APGE电泳，银染 定量，根据每个涌道染色情况微调蛋白浓度，保证后续 实验中每组样本的蛋白量相同。