基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用

基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用

一、课程设计目的

了解工业生产中的新型育种技术并比较不同育种技术的优势；

学习理解基因工程育种技术及其操作原理；

研究基因工程育种技术在人干扰素生产中的创新。

二、课程设计题目描述与要求

本文介绍一种二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术——基因工程，介绍其在育种中的应用。文中重点介绍了基因工程育种的一般步骤，以及近年来出现的运用基因工程进行定向育种的主要新技术：基因的定点突变，易错PCR，DAN重排及基因组重排。之后，应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素a2b, 通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。不同的葡萄糖流加方式有各自的优点,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表达量达到6 540 mg/L,高于目前已知文献中hIFNa2b的最高表达量5 200 mg/L。

三、课程设计报告内容

引言

基因工程是二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术，其发展从根本上改变了生物技术的研究和开发应用模式。1972年美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV 40DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦佛大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素连个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果的出现及应用，基因工程带来了一场新的革命。

利用这些技术，可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。通过转入外源基因，微生物和动、植物细胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。同样，利用重组DNA技术，也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子(抗生素)或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术的完善和发展，以基因水平为核心的现代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注，并展示了良好的应用前景。

1、基因工程育种

基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。

1.1 基因工程育种的一般步骤是：

(1)目的基因的获得：一般通过化学合成法、物理化学法(包括密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法(逆转录法)、Norther

杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法、编码序列富集(磁珠捕获)、产物导向法、Nod连接片段筛选法、外显子捕获法及外显子扩增法、剪接位点筛选法、作图克隆法、杂交细胞克隆法、消减杂交法、相同序列克隆法、差异显示逆转录PCR法、显微克隆与微克隆法和插入诱变法等方法获得目的基因。

(2)载体的选择：基因工程载体主要是质粒和病毒，载体一般为环状DNA，其要求有自我复制能力、分子小、拷贝数多、易连接和易筛选等特点。

(3)重组子体外构建：主要方法有粘性末端连接法、平端连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法。

(4)重组载体导入受体细胞：其主要途径有转化、转导、显微注射、电穿孔法、快速冷冻法和炭化纤维介导法等。

(5)重组体筛选和鉴定：以合适的筛选方法选择具有最佳性能的突变重组子，重组体筛选和鉴定主要通过表型法、DNA鉴定筛选法，选择性载体筛选法、分子杂交选择法、免疫学方法和mRNA翻译检测法等方法来实现。

1.2 运用基因工程进行定向育种的新技术

1．2.1 基因的定点突变

定点突变(site—specific mutagenesis或site—directed mutagenesis)是指在目的DNA片断(例如：一个基因)的指定位点引入特定的碱基对的技术，其包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以PCR为基础的定点突变。近十年来，定点突变技术获得了长足的发展，并且在此基础上又发展了很多新技术。例如：重叠延伸PCR法(Overlap Extension PCR简称EO—PCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重叠延伸PCR(One—stepOverlap Extension PCR，简称OOE．PCR)、单管大引物PCR(Single—tube Megaprimer PCR)、快速定点诱变法、多位点环状诱变法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定点诱变技术。在这些技术中，单管大引物PCRTAMS定点诱变技术最为简单和适用，并得到广泛的应用。

单管大引物PCR Picard等和HKe等分别建立了单管大引物PCR法。该法省去了传统上以PCR为基础的定点突变中第1轮PCR产物的纯化过程，实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应的定点突变目标。在上述2组研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、简单(图1)。其只需设计Tm值不同的2个侧引物，在第1

轮PCR反应中用Tm值低的侧引物(F1)和诱变引物，在较低的退火温度下进行扩增反应，产生大引物；然后再加入Tm值高的侧引物(F2)，在较高的退火温度下进行第2轮反应，扩增出含突变位点的整个DNA产物。Ke等在此方法中还提出了2条更为细致、有效的改进措施，使PCR产物的最终产量和纯度均有所提高。这2条改进措施为：(1)在第1轮PCR反应中，诱变引物的浓度仅为侧引物的1％，以减少诱变引物在第2轮PCR中的干扰作用；(2)在第l轮PCR反应后，亦即第2轮PCR反应前，增加5个循环的不对称扩增，这有利于提高其后的扩增效率。这种单管大引物法的优点是：实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应，大幅简化了操作步骤，并且省时、省力。在对多个样品进行操作时，该方法的优点更为突出。在以PCR为基础的诱变方法中，该法是引入单位点突变最简单、最经济的方法。

图1 单管大引物PCR过程

Figure 1 The process of Single·tube megaprimer PCR

TAMS定点诱变技术 2003年，Young等报道了一种有目的地扩增突变链的定点诱变技术(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。该技术能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的地扩增突变链，从而使突变效率几乎达到100％。该方法主要分3步(图2)：(1)线性单链DNA模板的制备：通过线性PCR 制备单链DNA模板；(2)突变链的合成：该步骤需用2个锚锭引物(即Anchor5和Anchor3)和多个诱变引物(Mut1和Mut2)。(3)有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3)，使其3′端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增引物