第2章大肠杆菌基因工程
2基因工程的酶学基础
GCGC NarI BsaHI
GGCC
BbeI HaeII XbaI Bcl I
FspI
ApaI BanII
Bsp1286
T****A T****A NruI T****A T****A
EaeI MscI
GTAC **** **** **** **** A****T A****T A****T A****T A****T
② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I
Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶
限制和修饰 单一多功能的酶 活性 内切酶和甲基 共同亚基的双 化酶分开 功能酶
内切酶的蛋 3种不同的亚基 白结构 限制作用所 ATP、 Mg2+和SAM 需要的辅助 因子 寄主特异性 EcoB： 位点识别序 TGA(N)8TGCT 列 EcoK： AAC(N)6GTGC
BamH I Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A
BfaI
DpnI
HinpI
HaeIII HhaI
生物技术制药习题答案
第一章绪论选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。
2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。
3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。
简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。
代表产品如酒、醋、乙醇，乳酸，柠檬酸等。
（2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技术发展速度快。
代表产品有青霉素，链霉素，红霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。
生物技术制药课后思考题
第一章：绪论思考题1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。
答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。
（具体定义见P1）。
2.生物技术药物的概念及分类。
答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。
2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。
3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。
答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短；e.有种属特异性；f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。
4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。
答：1）指利用基因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。
2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。
第二章：基因工程制药思考题1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。
答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。
大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4、大肠杆菌JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5、大肠杆菌TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因工程-外源基因在大肠杆菌中的表达2
基因工程5 2 3 4 16789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化6.3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略6 外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建细胞定位包涵体型异源蛋白的表达重组异源蛋白的细胞定位胞质型、周质型（内膜与外膜之间的空隙）和胞外型将重组异源蛋白引导至何种特定的细胞间隔各有利弊。
优选胞质，原因是在胞质型表达的表达水平高。
包涵体型异源蛋白的表达（胞质型）分泌型异源蛋白的表达（周质型或胞外型）融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建单独表达融合表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies ，IB ）。
富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。
由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。
除此之外，包涵体中还含有少量的DNA 、RNA 和脂多糖等非蛋白分子。
包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点高效表达重组异源蛋白包涵体表达形式的优点：以包涵体形式表达的重组异源蛋白可达细菌蛋白总量的20%-60%。
具有固相特性，从而简化外源基因表达产物的分离纯化包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成份，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。
基因工程(第二章答案)
第二章基因工程工具酶一、解释下列名词1.Restriction and modification（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends(or cohesive end)（匹配末端或粘性末端）识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Star activity星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
5. Klenow fragment Klenow 片段。
Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。
6.Reverse transcriptase反转录酶。
即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。
7.Terminal transferase（末端转移酶）8.Ligase连接酶。
催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。
9.T4 polynucleotide kinase（T4多聚核苷酸激酶）催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。
10.Alkaline phosphatase（碱性磷酸酶）催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸11.S1 nuclease Sl 核酸酶。
可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
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遏Plac介导的转录。因此，
基因工程中使用的乳糖启动
Plac
O
高效转录
子均为抗葡萄糖代谢阻遏的
突变型，即Plac UV5
Plac UV5
O
色氨酸
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸
阻遏蛋白
基底水平转录
Apr MCS
PL
pCP3
ori
三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达
寡聚型异源蛋白的表达
整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
包涵体型异源蛋白的表达
（1）包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它
第2章 大肠杆菌基因工程
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
四、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 五、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
ori Apr pCP1
Tcr
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的
频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大
肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
（2）强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终
止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的
rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对 于一些终止作用较弱的终止子，通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选
外源基因全合成 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适
宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在
大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法
同步表达相关tRNA编码基因
对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分 子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含 有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞
脂多糖等非蛋白分子
（2）以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的优点： 能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体
经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂
解物中分离出来
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组 蛋白的稳定性已构不成威胁
终止子
（1）强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑
过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；
E
A
目的基因
E
目的基因 E E 启动子
A 酶切开
Bal31酶解
（2）启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK 终止密码子
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；
翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG 作为阅读框架的起 始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
（2）核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响：
中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠
杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个
高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体
细胞对外源基因高效表达的制约作用
质粒拷贝数
(1)质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生 长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增
包涵体表达形式的缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通 过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具
有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产
之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均
会导致翻译起始效率不同程度的降低
起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG
三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%
而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区 形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的cI突 Ptrp A
阻遏作用
目的基因
cI857 PL B
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋
在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因 此常使用一个双质粒控制系统， 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp A 色氨酸 PL B 表达
（1）核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的 6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，
即 Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基 中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将
T A T A A T
T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
（4）启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O
被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子
（1）启动子最佳距离的探测
们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不
溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和
乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或
CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
SD序列与起始密码子之间的距离的影响： SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
ori
含有外源启动子活性的重组克隆
（3）启动子的构建
启动子
PlL
-35 区序列
T T G A C A
-10 区序列
G A T A C T
PrecA
PtraA Ptrp Plac Ptac
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
密码子
(1)生物体对密码子的偏爱性
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码 子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是： 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体 fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；