第2章大肠杆菌基因工程
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E
A
目的基因
E
目的基因 E E 启动子
A 酶切开
Bal31酶解
(2)启动子的筛选
采用鸟枪法战略,将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK 终止密码子
粒上报告基因galk的表达产物联合作用,
可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
T A T A A T
T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
(4)启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性:
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起,在没有诱导物 存在时,整个操纵子处于基 底水平表达;诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷(IPTG) 诱导 O
被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子
(1)启动子最佳距离的探测
Apr MCS
PL
pCP3
ori
三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达
寡聚型异源蛋白的表达
整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
包涵体型异源蛋白的表达
(1)包涵体及其性质
在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它
来自百度文库
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗;
更为严重的是,过长的转录物往往不能形成理想的二级结构,从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
(2)强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终
止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的
rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对 于一些终止作用较弱的终止子,通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构,以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样,通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选
第2章 大肠杆菌基因工程
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
四、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 五、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
终止子
(1)强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达,容易发生转录过头现象,即RNA聚合酶滑
过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列,形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下: 转录产物越长,RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加,外源基因 本身的转录效率下降; 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域,如选择性标 记基因和复制子结构等,则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能,甚至导致重组质粒的不稳定性;
基底水平转录 阻遏蛋白
高效转录
P
O
乳糖启动子Plac的可控性:
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子(CAP)结合 区,cAMP激活CAP,CAP 结合启动子控制区,进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少,也能阻 Plac O cAMP 高效转录
CAP
葡萄糖代谢
cAMP浓度降低
Ptrp 除去色氨酸
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 (IAA) 高效转录
或者加入3-吲哚丙烯酸(IAA),
便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中,除去 色氨酸是困难的,因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达 Ptrp Otrp
高效转录
Ptrp
Otrp
l噬菌体启动子PlL的可控性:
脂多糖等非蛋白分子
(2)以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的优点: 能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分,菌体
经超声波裂解后,直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂
解物中分离出来
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
在形成包涵体之后,大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组 蛋白的稳定性已构不成威胁
(1)核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素:
位于翻译起始密码子上游的 6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’,
即 Shine-Dalgarno(SD)序列,它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基 中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合,将
殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢,进
而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的 轨道
(2)质粒扩增时序的控制
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 在28℃时,每个细胞的质粒拷贝数为60 在42℃时,拷贝数迅速增至300 - 600 在此温度下,受体细胞染色体上的CI基 因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 因此,用一种手段同时控制质粒拷 贝数和基因的表达
mRNA定位于核糖体上,从而启动翻译;
翻译起始密码子,大肠杆菌绝大部分基因以 AUG 作为阅读框架的起 始位点,但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子; SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成; 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
(2)核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响:
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
ori
含有外源启动子活性的重组克隆
(3)启动子的构建
启动子
PlL
-35 区序列
T T G A C A
-10 区序列
G A T A C T
PrecA
PtraA Ptrp Plac Ptac
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
ori Apr pCP1
Tcr
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的
频率,而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大
肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率,它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定,称为核糖体结合位点(RBS)
外源基因全合成 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律,设计更换外源基因中不适
宜的相应简并密码子,重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在
大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法
同步表达相关tRNA编码基因
对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分 子量又较大的外源基因而言,则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利。例如,在人尿激酶原cDNA的412个密码子中,共含 有22个精氨酸密码子,其中7个AGG、2个AGA,而大肠杆菌受体细胞
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏,很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的cI突 Ptrp A
阻遏作用
目的基因
cI857 PL B
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋
在42℃时失活脱落,PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难,因 此常使用一个双质粒控制系统, 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp A 色氨酸 PL B 表达
密码子
(1)生物体对密码子的偏爱性
不同的生物,甚至同种生物不同的蛋白质编码基因,对简并密码 子使用频率并不相同,具有一定的偏爱性,其决定因素是: 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物(如单链DNA噬菌体 fX174)基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高;而在GC 丰富的生物(如链霉菌)基因组中,第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少; 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多;
之前大约七个碱基处,在此间隔中少一个碱基或多一个碱基,均
会导致翻译起始效率不同程度的降低
起始密码子及其后续若干密码子的影响: 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG
三种起始密码子,但其识别频率并不相同,通常GUG为AUG的50%
而UUG只及AUG的25%。除此之外,从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要,至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区 形成茎环结构,否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上,均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列,序列和间隔是最佳的
细胞内tRNA的含量
(2)密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程
大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高
效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言,有两种策略
可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达: 外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠
杆菌中的高效表达,将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个
高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体
细胞对外源基因高效表达的制约作用
质粒拷贝数
(1)质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝,质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生 长期内,而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增
们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不
溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB)。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中,由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能,从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质,后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外,包涵体中还含有少量的DNA、RNA和
乳糖苷酶的mRNA而言,在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或
CUU,如果用UUC、UCA或AGG取代之,则酶的表达水平低20 倍
SD序列与起始密码子之间的距离的影响: SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后,翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位,这是翻译启动的前提条件。在很多情况下,SD序列位于AUG
一般来说,mRNA与核糖体的结合程度越强,翻译的起始效
率就越高,而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱
基互补性,其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言,上述四个碱基中任何一个换成C或T,均会导致翻译效率大幅 度降低
SD序列与起始密码子之间的序列的影响: SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU,翻译效率最高;而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响,对于大肠杆菌b-半
基底水平转录
遏Plac介导的转录。因此,
基因工程中使用的乳糖启动
Plac
O
高效转录
子均为抗葡萄糖代谢阻遏的
突变型,即Plac UV5
Plac UV5
O
色氨酸
色氨酸启动子Ptrp的可控性:
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏,转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸
阻遏蛋白
基底水平转录
包涵体表达形式的缺点: 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性,必须通 过有效的变性复性操作,才能回收得到具有正确空间构象(因而具
有生物活性)的目标蛋白,因此包涵体变复性操作的效率对目标产
A
目的基因
E
目的基因 E E 启动子
A 酶切开
Bal31酶解
(2)启动子的筛选
采用鸟枪法战略,将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK 终止密码子
粒上报告基因galk的表达产物联合作用,
可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
T A T A A T
T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
(4)启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性:
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起,在没有诱导物 存在时,整个操纵子处于基 底水平表达;诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷(IPTG) 诱导 O
被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子
(1)启动子最佳距离的探测
Apr MCS
PL
pCP3
ori
三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达
寡聚型异源蛋白的表达
整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
包涵体型异源蛋白的表达
(1)包涵体及其性质
在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它
来自百度文库
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗;
更为严重的是,过长的转录物往往不能形成理想的二级结构,从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
(2)强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终
止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的
rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对 于一些终止作用较弱的终止子,通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构,以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样,通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选
第2章 大肠杆菌基因工程
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
四、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 五、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
终止子
(1)强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达,容易发生转录过头现象,即RNA聚合酶滑
过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列,形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下: 转录产物越长,RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加,外源基因 本身的转录效率下降; 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域,如选择性标 记基因和复制子结构等,则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能,甚至导致重组质粒的不稳定性;
基底水平转录 阻遏蛋白
高效转录
P
O
乳糖启动子Plac的可控性:
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子(CAP)结合 区,cAMP激活CAP,CAP 结合启动子控制区,进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少,也能阻 Plac O cAMP 高效转录
CAP
葡萄糖代谢
cAMP浓度降低
Ptrp 除去色氨酸
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 (IAA) 高效转录
或者加入3-吲哚丙烯酸(IAA),
便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中,除去 色氨酸是困难的,因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达 Ptrp Otrp
高效转录
Ptrp
Otrp
l噬菌体启动子PlL的可控性:
脂多糖等非蛋白分子
(2)以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的优点: 能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分,菌体
经超声波裂解后,直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂
解物中分离出来
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
在形成包涵体之后,大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组 蛋白的稳定性已构不成威胁
(1)核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素:
位于翻译起始密码子上游的 6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’,
即 Shine-Dalgarno(SD)序列,它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基 中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合,将
殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢,进
而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的 轨道
(2)质粒扩增时序的控制
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 在28℃时,每个细胞的质粒拷贝数为60 在42℃时,拷贝数迅速增至300 - 600 在此温度下,受体细胞染色体上的CI基 因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 因此,用一种手段同时控制质粒拷 贝数和基因的表达
mRNA定位于核糖体上,从而启动翻译;
翻译起始密码子,大肠杆菌绝大部分基因以 AUG 作为阅读框架的起 始位点,但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子; SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成; 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
(2)核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响:
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
ori
含有外源启动子活性的重组克隆
(3)启动子的构建
启动子
PlL
-35 区序列
T T G A C A
-10 区序列
G A T A C T
PrecA
PtraA Ptrp Plac Ptac
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
ori Apr pCP1
Tcr
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的
频率,而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大
肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率,它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定,称为核糖体结合位点(RBS)
外源基因全合成 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律,设计更换外源基因中不适
宜的相应简并密码子,重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在
大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法
同步表达相关tRNA编码基因
对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分 子量又较大的外源基因而言,则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利。例如,在人尿激酶原cDNA的412个密码子中,共含 有22个精氨酸密码子,其中7个AGG、2个AGA,而大肠杆菌受体细胞
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏,很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的cI突 Ptrp A
阻遏作用
目的基因
cI857 PL B
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋
在42℃时失活脱落,PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难,因 此常使用一个双质粒控制系统, 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp A 色氨酸 PL B 表达
密码子
(1)生物体对密码子的偏爱性
不同的生物,甚至同种生物不同的蛋白质编码基因,对简并密码 子使用频率并不相同,具有一定的偏爱性,其决定因素是: 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物(如单链DNA噬菌体 fX174)基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高;而在GC 丰富的生物(如链霉菌)基因组中,第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少; 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多;
之前大约七个碱基处,在此间隔中少一个碱基或多一个碱基,均
会导致翻译起始效率不同程度的降低
起始密码子及其后续若干密码子的影响: 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG
三种起始密码子,但其识别频率并不相同,通常GUG为AUG的50%
而UUG只及AUG的25%。除此之外,从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要,至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区 形成茎环结构,否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上,均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列,序列和间隔是最佳的
细胞内tRNA的含量
(2)密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程
大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高
效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言,有两种策略
可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达: 外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠
杆菌中的高效表达,将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个
高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体
细胞对外源基因高效表达的制约作用
质粒拷贝数
(1)质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝,质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生 长期内,而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增
们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不
溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB)。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中,由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能,从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质,后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外,包涵体中还含有少量的DNA、RNA和
乳糖苷酶的mRNA而言,在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或
CUU,如果用UUC、UCA或AGG取代之,则酶的表达水平低20 倍
SD序列与起始密码子之间的距离的影响: SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后,翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位,这是翻译启动的前提条件。在很多情况下,SD序列位于AUG
一般来说,mRNA与核糖体的结合程度越强,翻译的起始效
率就越高,而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱
基互补性,其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言,上述四个碱基中任何一个换成C或T,均会导致翻译效率大幅 度降低
SD序列与起始密码子之间的序列的影响: SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU,翻译效率最高;而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响,对于大肠杆菌b-半
基底水平转录
遏Plac介导的转录。因此,
基因工程中使用的乳糖启动
Plac
O
高效转录
子均为抗葡萄糖代谢阻遏的
突变型,即Plac UV5
Plac UV5
O
色氨酸
色氨酸启动子Ptrp的可控性:
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏,转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸
阻遏蛋白
基底水平转录
包涵体表达形式的缺点: 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性,必须通 过有效的变性复性操作,才能回收得到具有正确空间构象(因而具
有生物活性)的目标蛋白,因此包涵体变复性操作的效率对目标产