灭菌及无菌空气的制备

• 工业上具体措施包括：
– 1）使用的培养基和设备须经灭菌；
– 2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理
– 3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；
– 4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；
– 5）使用无污染的种子。
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• 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
消毒(disinfection)：用物理或化学方法杀死物料、容器器具 内外病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。 一般只能杀死营养细胞，例如巴氏消毒法（60℃，30min）。
适用范围：对压缩空气制备无菌空气；酶溶液、啤酒 及其他不耐热化合物溶液除菌。
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第一节 培养基和发酵设备的灭菌
高压蒸汽灭菌利用饱和蒸汽的高温杀死微生物的同时， 高温还可能造成培养基成分的损失。
培养基灭菌的要求：
• 达到要求的无菌程度
• 尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的
破坏，是由两个基本类型的反应引起的： – 培养基中不同营养成分间的相互作用； – 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解
培养基的营养成分的破坏和菌体死亡都符合Arrhenius Equation方程:
微生物
反应速度常数增加的倍数
营养成分
K值为比死亡速率
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反应速率常数
k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。
T相同，k值越小，则微生物越是耐热。
同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，k值越小， 温度越高，k值增大。
• 合理选择灭菌条件的关键：了解灭菌温度、时间对微生物
死亡和培养基成分破坏的关系。
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致死温度：杀死微生物的极限（最低）温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间成为致死时间； 在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。
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一、培养基的灭菌温度选择
用湿热灭菌方法对培养基灭菌时，加热的温度和时间 对微生物死亡和营养成分均有破坏作用，因而选择一种既 能达到灭菌要求又能减少营养成分被破坏的温度和受热时 间，是研究培养基灭菌质量的重要内容。
灭菌(sterilization)：用物理或化学方法杀死或除去物料、 空气容器等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽 孢和孢子。
关系：消毒不一定达到灭菌的要求，而灭菌可以达到消毒的目的。
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常用消毒、灭菌原理与方法
• 化学药剂消毒：甲醛或新洁尔灭、高锰酸钾等
– 使蛋白质凝固变性、酶失活；破坏细胞膜；
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二、影响培养基灭菌的其它因素
除了灭菌温度和时间外，影响灭菌效果的因素还有：
1．培养基 pH值 ：
培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的pH值越低，所需杀 灭微生物的温度越低。pH6.0-8.0时最难灭菌。
pH值对灭菌时间的影响
温度 （℃）
120 115 110 100
孢子数 （个/mL) pH6.1
适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌
• 例如：实验室内的高压蒸汽灭菌、发酵车间采用的 设备空消和培养基实消。
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过滤介质除菌法
• 过滤介质除菌
– 采用适当的过滤介质对热敏性的液体或气体进行过 滤，去除微生物的方法。
– 液体：0.22μm或0.45μm滤膜 – 气体：纤维介质滤材捕捉极微小的悬浮微生物
细菌芽孢名称
121℃某些细菌芽孢的k值
k值/min-1
枯草芽孢杆菌FS5230 硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518 硬脂嗜热芽孢杆菌FS617 产气梭状芽孢杆菌PA3679
3.8~2.6 0.77 2.9 1.8
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随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反 应速度常数增加的倍数。
10000
8
10000
25
10000
70
10000
740
灭菌时间（min）
pH5.3
• 物理方法
– 辐射灭菌：紫外线、X射线，高能辐射与菌体核酸光化学反应
– 干热灭菌法：氧化作用、高温使蛋白质变性和电解质浓缩中毒
– 湿热灭菌法（最常用）：蒸汽热使蛋白质变性，大分子氢键收到
破坏；
– 过滤介质除菌√：微生物不能透过滤膜而除菌
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湿热灭菌法
• 蒸汽具有强的热穿透力，灭菌易于彻底，效果最好，应用 饱和蒸汽进行灭菌最为普遍。
• 达到相同灭菌效果时，温度T越高，K值越大（比死亡速率常数），所需 灭菌的时间t 越短。
• 在实际生产中为了既达到灭菌目的又较好地保存营养成分，最好采用较 高的温度，较短时间进行灭菌，瞬时高温灭菌UHT。即可达到杀死培养 基中的全部微生物的目的，又可减少营养成分的破坏。
• 通常情况选择灭菌温度为121℃，当培养基中含热敏成分，则降低温度
Nt: 培养基经灭菌时间t后中的残留活菌数（灭菌程度一般为0.001，
即1000次有一次失败），灭菌程度
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在计算灭菌时间过程中需考虑两个问题：
一是一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计 算依据；
二是灭菌程度，即残留菌数，一般采用Nt=0.001，即 1000次灭菌中有一次失败。
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发酵的一般流程
培养基配制
种子扩大培养
空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下编辑游pp处t 理
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第五章 灭菌及无菌空气制备
• 发酵工程无菌技术：
– 纯培养发酵技术：发酵全过程只有生产菌，无杂菌
• 在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的不良后果：
– 杂菌污染使基质或产物被杂菌消耗，造成生产能力下降； – 杂菌产生的某些代谢产物，改变了培养液的理化性质，使提取精
制发生困难； – 杂菌可能会降解目的产物，使得生产过程失败； – 杂菌会污染最终产品； – 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象，使生产失败
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➢ 为了保证培养过程的正常进行，在接种要培养的微生 物之前，需要进行灭菌与消毒。
灭菌对象：培养基；设备与管道；空气系统；流加料、消泡剂； 必要时还有对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体
微生物
营养成分
芽孢
VB2
118℃, 15min
99.99%
10%
120℃, 1. 5min
99.99%
5%
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在确定了培养基灭菌的温度后，如何来计 算灭菌时间？
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k
Nt
t: 发酵培养基的灭菌时间
k: 比死亡速率，min -1,不同微生物在某一温度下的k值差异
N0: 开始灭菌时培养基物料中的活菌数，污染程度