猪流感的诊断技术研究进展

蛋白具有识别并吸附红细胞表面受体的结构，同时， ＨＡ蛋白的抗体与该蛋白受体的特异性结合能够干 扰ＨＡ蛋白与红细胞受体的结合，基于这一原理， ＤｕｅａＭ等¨ｏ在１９４２年建立了血凝试验（ＨＡ）和血 凝抑制试验（ＨＩ）。由于血凝试验方便、快捷、易于 操作，常用于检测培养物中的流感病毒。
１．３．２
免疫荧光法（ＩＦＡ）
万方数据
７６
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖａｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２０１０年第６期
昂贵，而且需要熟练的技术操作人员，故Ｉ临床检测价 值较低。
１．２
Ｄｅｕｓｏｎ等对常量ＮＩ试验方法进行了改造，建立
了微量ＮＩ试验方法，既降低了抗原用量，又可对多 种分离物同时进行抗原分类，为此，一直被世界卫生 组织推荐用于ＮＡ亚型的分类。美国国立兽医实验 所已将微量Ｎｌ试验方法列为流感病毒分离物定型 及筛选畜禽血清亚型ＮＡ抗体的常规方法∞。。
１
１．１
ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）属引起的
一种猪的急性、高度接触性呼吸道传染病，以突发、 咳嗽、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡为特征；各种 年龄、性别和品种猪均能感染，发病率高，恢复缓慢， 阻碍增重，降低料肉比，直接影响猪群健康状态和质 量，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪群发 性疾病之一。对养猪业危害极大。自１９１８年首次报 道猪流感以来，迄今为止，欧、美、非、亚、澳等世界各 大洲均有猪流感的发生和流行。迄今已发现的Ａ 型ＳＩＶ有Ｈ１
Ａｃａｄｅｍｙ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌａａｚｈｏｕ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ
２Ｃｏｌｌｅｇｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００４６； ７３００７０）
ｈｕ－
摘要：
猪流感是由猪流感病毒引起的一种猪的急性、高度接触性呼吸道传染病，不仅给畜禽养殖造成重大经济损失，
而且还对人类健康造成威胁。因此快速、敏感、准确诊断猪流感，具有重要的经济价值和公共卫生意义。从传统的实验室诊断 技术和分子生物学诊断技术两方面综合阐述了猪流感的诊断研究进展。 关键词：猪流感诊断技术研究进展
收稿口期：２０１０．０２－０２ 基金项目：重大基础研究“９７３”前期研究专项（２００４ＣＣＡ００５００），国家“８６３”项目（２００６ＡＡｌ０Ａ２０４） 作者简介：李困娟，女，在读硕士，研究方向：微生物学；Ｅ・ｍａｉｌ：ｇｕｏｊｕａｎｌ０２３＠１６３．ｃｏｒｎ 通讯作者：柳纪省，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｊ／ｘｉｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ
ＩＦＡ的最大优点是稳
定、敏感性和特异性高，值得推广应用。早在１９６１ 年ＩＦＡ就开始用于人类流感的快速诊断，此后又有 很多学者用该方法检测流感病毒。用于猪流感诊断 的方法，有直接荧光抗体法和间接荧光抗体法，但多 用间接荧光抗体法。Ｏｎｎｏ等¨１用基于ＮＰ单克隆 抗体的间接免疫荧光技术对试验感染猪鼻上皮细胞 中的抗原进行检测，特异性荧光出现在感染细胞的 细胞浆和细胞核内，结果表明该法与鸡胚分离病毒 一样敏感，并且能在数小时内快速得到诊断结果。
ｃａｕｓｅｓ
ｇｒｅａｔ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｌｏｓｓｅｓ，ｂｕｔ ａｌｓｏ
ｔｏ
ｈｅａｌｔｈ ｔｈｒｅａｔｓ，ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｆｉｎｄ ｆａｓｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｆｌｕ．Ｔｈｉｓ
ｐａｐｅｒ
ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
１．３．４
病毒分离和鉴定 从待检病料样品中分离和培养ＳＩＶ在检测宿主
范围和致病机理的研究及疫苗生产等方面都很重 要。猪流感病毒可在鸡胚和培养细胞中增殖，由于 鸡胚中增殖敏感性高，通常被称为ＳＩ诊断的“金标 准”…。王连想等旧１在２００３年报道分离了猪流感 病毒广东株并鉴定其为Ｈ１ Ｎ１亚型毒株；许传田 等旧１在２００４年报道从山东各地疑似流感发病猪分 离并鉴定到Ａ型流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型；李海燕等Ｈ１ 报道通过病毒分离和鉴定首次发现我国猪群已出现 ＨＳＮＩ亚型流感病毒。
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｗｉｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ
猪流感（ｓｗｉｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＳＩ）是由正粘病毒科Ａ 型猪流感病毒（ｓｗｉｎｅ
１．３．８
ＨＭＡ），可早期识别动物流感和人流感的种
间传播。祈贤等¨纠针对ＳＩＶ保守基因ＮＰ建立了套 式ＲＴ—ＰＣＲ，用于猪流感的检测。Ｙｏｕｎｇ等（２００２）建 立了多重ＲＴ—ＰＣＲ来检测和鉴别Ｈｌ型和Ｈ３型猪 流感病毒，并且与血凝试验结果相符合，结果表明所 建立的多重ＲＴ—ＰＣＲ可用于检测临床样品中不同亚 型的猪流感。Ｊｕｒｇｅｎ等（２００４）建立了针对Ａ型猪 流感病毒Ｖｌ基因的实时ＲＴ．ＰＣＲ，用来检测和区别 Ｈ１和Ｈ３亚型猪流感。与病毒分离相比，实时ＲＴ． ＰＣＲ的敏感性为９４％，特异性为８５％，ＨＩ，Ｈ３，Ｎ１ 和Ｎ２特异性引物和探针检测的敏感性低于Ｍ基因 的检测。
１．３．７
血凝抑制（ＨＩ）试验血凝抑制试验敏感、
特异，常用于甲型流感病毒亚型的鉴定和抗原变异 的分析，值得注意的是，许多动物血清中有非特异性 血凝因子，可能会有假阳性的出现，故通常用受体破 坏酶（ｒｅｃｅｐｔｏｒ
１．３．３ ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ
ｅｎｚｙｍｅ，ＲＤＥ）或高碘酸钠 ＮＩ主要用于
法去除非特异性抑制因子。 神经氨酸酶抑制（ＮＩ）试验 流感病毒的表面抗原ＮＡ的亚型鉴定。１９８３年，
１．３
中和试验（ＳＮ）用ＳＮ来鉴定或滴定ＳＩＶ
时，一般常选用对病毒敏感的组织培养细胞或鸡胚。 ｓＮ是较敏感、特异的血清学方法，但只有抗体与病 毒上的表面抗原相对应，特别是与吸附到宿主细胞 上的病毒表面抗原相对应时才能取得确切的试验结 果…。ｓＮ在研究应用中较广泛，但其操作繁琐、时 间长（一周左右），故很少用于临床进行疾病诊断。 但其作为经典方法在病毒分离鉴定中起重要的作 用，许多新的检测方法都要以其为标准方法进行比 较研究。
生物技术通报
・技术与方法・
ＢｌｏＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹ
ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２０１０年第６期
猪流感的诊断技术研究进展
李国娟１，２ 柳纪省１．李宝玉１
田永强２
（１中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽 病毒学重点开放实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室，兰州７３００４６； ２兰州交通大学化工学院，兰州７３００７０）
ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｌａｎｚｈｏｕ
Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
ｍａｎ
Ｓｗｉｎｅ ｆｌｕ ｉｓ
ａｎ
ａｃｕｔｅ ｔｏ
ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｃａｕｓｅｄ ｂｙ
ａｃｃｕｒａｔｅ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ｎｏｔ ｏｎｌｙ
１．３．５
血清学诊断 常规亚型鉴定最实用的确诊方法是血清学诊断
技术，即红细胞凝集（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ，ＨＡ）试验，血 凝抑制（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉ仰ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＨＩ）试验，神经氨 酸酶抑制（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＮＩ）试验，中和试 验（ｓｅｒｕｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｔ，ＳＮ），琼脂凝胶扩散试验
ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
１９３０年在美国首次分离出来的，２００９年３月在墨西 哥、美国等地暴发的甲型ＨｌＮｌ流感病毒，是一种新 型的变异病毒株，这种新型流感病毒具有病毒杂交 特性，它包含人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒 的基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病 毒特征。猪流感不仅给畜禽养殖造成重大经济损 失，而且还对人类健康造成威胁，因此快速、敏感、准 确诊断猪流感，具有重要的经济价值和公共卫生 意义。
２．２
免疫过氧化酶单层细胞试验（ＩＰＭＡ）该
技术用于检测猪血清中的ＳＩＶ抗体。其特点特异性 强，可检测出感染后３ ｄ的抗体效价。
１．３．９
免疫组织化学（ＩＨＣ）试验免疫荧光技术
和免疫组织化学试验的敏感性相近，但免疫组织化 学试验能用于尸检时固定良好，并且送检过程中没 丧失组织完整性的病料。ＳＩＶ感染后３ ｄ，肺部细胞 感染的数量达到高峰，到第５天时许多病毒都已经 排出。Ｋｗｏｎｉｌ等（２００５）也应用免疫组织化学试验 对Ｈ１Ｎ２亚型猪流感进行了确诊，证实韩国２００５年 首次报道发生的Ｈ１Ｎ２亚型猪流感。
Ｎ１，Ｈｌ Ｎ２，Ｈ１ Ｎ７，Ｈ２Ｎ３，Ｈ３Ｎ１，Ｈ３Ｎ２，
传统的诊断技术
电镜技术 通过电镜技术，观察ＳＩＶ的病毒粒子，呈椭圆
Ｈ３Ｎ３，Ｈ３Ｎ６。Ｈ４Ｎ６，Ｈ５Ｎ１和Ｈ９Ｎ２等１１种不同亚 型。我国流行的猪流感亚型主要有类人型Ｈ３Ｎ２， 古典猪Ｈ１Ｎｌ和类禽型Ｈｌ Ｎｌ三种。Ｈ１Ｎ１病毒是
形，棒状和圆形，直径约为８０—１２０ ｎｍ。虽然电镜 技术直接、客观，但是对病毒滴度不仅要求高，设备
酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡ是目
万方数据
２０ｌＯ年第６期
李国娟等：猪流感的诊断技术研究进展 有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，故是生物学最 有价值的研究手段之一。针对Ａ型流感病毒的诊 断，Ａｔｌｎａｒ（１９９６）建立了ＲＴ－ＰＣＲ方法。针对流感病 毒具有多种型和亚型的情况，Ｗｒｉｇｈｔ（１９９５）建立了 区分型和亚型的ＰＣＲ法。 近年来，一些基于不同靶基因的ＲＴ—ＰＣＲ检测 方法在国外相继建立。Ｅｌｌｉｓ等¨刮建立了检测和鉴 别不同物种Ａ型流感病毒的ＲＴ—ＰＣＲ异源双链核酸 分子迁移试验（ＲＴ．ＰＣＲ
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
Ｌｉ
ｏｎ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｌｉｕ
Ｇｕｏｊｕａｎｌ・２
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
Ｊｉｘｉｎ９１
Ｌｉ Ｂａｏｙｕｌ
Ｔｉａｎ Ｙｏｎｇｑｉａｎ９２
Ｋｅｙ
（１Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＡｎｉｍａｌ
ｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｔａｔｅ
ＲＴ—ＰＣＲ ｈｅｔｅｒｏｄｕΒιβλιοθήκη ｌｅｘ ｍｏｈｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ，
前应用最广泛的病毒抗原及抗体的检测技术，已建 立了多种方法，如间接法、双抗体夹心法、捕获法和 生物素一亲和素法等。早在１９７４年就用于流感病 毒的检测【ｌ引，因其敏感性高，特异性强，操作简便， 肉眼可观察，便于大规模检测，适合于现场和基层使 用，被认为是近代血清学上革命性的新成果。 近年来，在传统ＥＬＩＳＡ方法的基础上，研究者 们对其做了进一步改进。Ｓｗｅｎｓｏｎ等¨刈应用膜酶免 疫试验和微孔膜免疫试验对流感病毒进行了检测； Ｖｏｅｔｅｎ等¨２１应用重组流感病毒核蛋白作为抗原包 被ＥＬＩＳＡ板，对流感患者进行特异性ＩｇＡ及ＩｇＧ抗 体检测，在感染后第６天，便可检测出特异性的 ＩｇＡ，故其可以作为流感早期的血清学诊断方法之 一。亢文华等¨列建立了ＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ方法快速检测 高致病性禽流感病毒。
１．３．６
ａｓｓａｙ，ＩＦＡ），酶联免疫吸附试验 ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ），免疫过
ｍｏｎｏｌａｙｅｒ
（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ
ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
氧化酶单层细胞试验（ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＩＨＣ）试验。
１．３．１
ａｓｓａｙ，ＩＰＭＡ），免疫组织化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 红细胞凝集（ＨＡ）试验ＳＩ颗粒表面的ＨＡ
（ａｇ ａｒｇｅｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ，ＡＧＩＤ），免疫荧光法（ｉｍ—
ｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓ．ｃｅｎｃｅ
琼脂凝胶扩散（ＡＧＩＤ）试验ＡＧＩＤ是在琼
脂凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应，该技术简 便、快捷，而且比较保守，基本不发生变异。由于 ＳＩＶ的不同亚型都具有型特异性抗原（ＮＰ蛋白），所 以可以用一种流感抗原或抗体对其所有抗体或抗原 进行检测。用标准抗原监测抗体时，标准抗原可以 是全病毒，也可以是基因产物。ＡＧＩＤ所用的抗原 和抗体的一种必须纯化，否则，易出现假阳性结果。 此外，ＡＧＩＤ的敏感性较差，经改进的ＡＧＩＤ免疫双 扩散试验，不仅提高了敏感性，而且快速省时¨Ｊ。 ＳＩＶ的检测手段中，ＡＧＩＤ操作比较简单，结果容易 判定，但其敏感性和ＨＩ试验一样偏低。国内已建立 了ＡＧＰ诊断技术及其诊断试剂盒。