伽马氨基丁酸的测定

操作要点: 选取籽粒饱满的稻米，去皮后用Pearlest 精米机处理 40s 成为精米。为了抑制发芽后的发酵味，用 1% 的次氯酸钠水溶液洗 1min，用灭菌的去离子水反复冲洗 3 遍。将处理好的精米用纱布包好，恒温浸泡，转入培养皿中发芽，保持培养皿湿润，每 3h 上下翻动一次。发芽结束后将培养皿放入55℃烘箱终止活性，干燥一定时间，取出粉碎。

1.2.2

GABA 含量测定

样品准备:将粉碎后的样品过 60 目筛，称取 2g，加入 5% 三氯乙酸水溶液 5mL，

30℃振荡提取 2h，离心(转速 10000r/min)10min，取上清液待测

色谱条件:单泵，流速为 0.9mL/min;色谱柱为Venusil MP－C18(4.6 × 250mm)，柱温 30℃;流动相为1.6g NaAc 〃3H2O 溶于 600mL 水中，pH7.2，甲醇200mL，乙氰 200mL;检测波长 338nm。

衍生化:吸取硼酸缓冲液(0.4mol/L，pH10.4)

1000μL，样品 200μL，OPA 衍生试剂 ( OPA 80mg，β－巯基乙醇 80μL，乙腈 10mL)200μL，混合均匀，暗室中室温反应 5min 后进样 20μL。

GABA 标准曲线的绘制:用配制好的 250mg/L

的标准液分别稀释 50、40、30、20、10、6、5 倍，柱前衍生，吸取 20μL 进样，重复三次，以 GABA 的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

衍生试剂（邻苯二甲醛OPA）的配制

０．５Ｍ硼酸钾溶液：称取３．１０００ｇ硼酸，２．６０００ｇ氢氧化钾于烧杯中，用双蒸水溶解，定容于１００ｍＬ容量瓶中，摇匀，用硝酸调节ｐＨ到９．５

邻苯二甲醛（ＯＰＡ）溶液：称取０．３０００ｇＯＰＡ，溶解于５ｍＬ甲醇，再溶解于１００ｍＬ０．５Ｍ硼酸钾溶液中，然后加入０．２５ｍＬ２－巯基乙醇［１９］，混匀，避光４℃冰箱中保存（最多可保留１周，最好现配现用）

γ- 氨基丁酸的分离提取

米糠中加入3～5 倍体积0.01mol/L 柠檬酸缓冲液(pH6.0)，37℃水浴电动搅拌抽提4h，减压抽滤，以4000r/min 离心30min，取出上清加入10% 磺基水杨酸离心弃沉淀，冷冻干燥后为黄粽色固体，将其溶解于蒸馏水中、上SephadexG-25层析柱(1.5×74cm)分离，蒸馏水洗脱，收集与茚三酮溶液反应呈阳性的洗脱液，浓缩，G A B A定性检查，所得样品调节 pH 值约为4，上磺酸型阳离子交换柱(2.0 ×30cm)，冰乙酸一吡啶缓冲液进行pH线性梯度洗脱，收集含 G A B A 洗脱液，浓缩，硅胶 H 薄板层析鉴定。

1.2.2

γ- 氨基丁酸含量的测定

比色法按Tsushida 中的方法[3]略加以改进；取样液300μl，加0.2mol/L pH10.0 硼酸盐缓冲液200μl，6% 重蒸酚100μl，混匀后再加入0.8ml 5% NaClO 溶液，振荡。于沸水浴中加热10min 后置冰浴5min，待溶液出现兰绿色后，加入2.0ml 60% 乙醇溶液，于波长645nm 处比色，并以已知浓度标准G A B A 溶液绘制标准曲线

仪器测定方法；用日定-838-50 型氨基酸自动分析仪测定。

硅胶 H 薄层层析，按文献[ 4 ]方法进行[4]

朱俭,曹凯鸣,周润崎,等.生物化学实验[M].上海:上海科技

出版社,1981.43-45.

从米糠中提取γ- 氨基丁酸条件实验

米糠分别用 0.01mo/L pH5.0、pH6.0 柠檬酸缓冲液、

0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液及蒸馏水抽提，测定比较在不同温度(25、37、50、60℃)条件下，不同搅拌抽提时

间(0.5、2、4、6h)，米糠提取液中γ- 氨基丁酸的含量

及水提取液中氨基酸的组成及含量分析。