转基因检测原理

基于蛋白质的转基因产品检测方法

1.酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)

ELISA是抗原抗体免疫反应和酶高效催化反应的有机结合，从20世纪70年代以来已在生物学领域广泛应用，该方法有两个特点，一是抗原抗体免疫反应在固体表面进行，二是用酶作为标记物进行蛋白质测定。

转基因植物表达的外源蛋白的抗体与被检测样品中的外源蛋白结合，再结合酶标抗体或酶标抗抗体，加入底物后通过酶促反应形成有色物质，根据颜色的深浅或酶标仪检测的结果判断是否为阳性。ELISA反应中，抗原抗体反应发生在固相微量滴定板上，抗原与抗体反应并产生稳定的复合物，经加入与酶连接的第二抗体可以显现，加入酶的底物后会产生颜色反应，因此可用分光光度计测量或肉眼检测(图3-1)。

ELISA方法有直接法、间接法和双抗夹心法，使用较多的是双抗夹心法，其检测灵敏度最高。一般的ELISA反应为定性检测，但若作出已知转基因成分含量与光密度值（OD）的标准曲线，也可根据标准曲线由未知样品的OD值来确定此样品中转基因成分的含量，达到半定量测定。一些ELISA试剂盒提供了标定物（已知浓度的液态目标分析物）和阴性对照（已知不含目标分析物）用于测试结果的显现和说明。这些标准品（标定物和对照）在给定的不同浓度（比如：0, 0.5 ppb, 1 ppb ,5 ppb ,10 ppb）显示不同的颜色。通过比较样品与标准品的颜色差别，就可以测定一定范围内样品的浓度，比如“1 ppb到5 ppb之间”。这种结果是

半定量的。若要得到定量的解释，可以将微孔板放到微量板读数仪去读数，微量板读数仪可以一次性准确地读出所有样品和标准品的光密度。再利用读数仪所提供的软件，便可从标准曲线上计算出样品浓度。

ELISA具备了酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性，具有简便、快速、费用低等特点，但易出现本底过高的问题，且只能检测目的蛋白抗原性没有明显变化的粗加工产品。直接法和双抗夹心法都要制备特异的酶标抗体，制备方法较繁琐，且一种酶标抗体只能检测一种蛋白，而适用于间接法的酶标抗抗体已有商品出售。一种转基因蛋白的检测试剂盒是否能在表达相同外源蛋白的不同植物之间通用还要进行试验。

2.侧向流动免疫测定法（Lateral Flow Strips)

“侧流”型免疫测定是最近15年发展起来的，该方法之前主要用于医学领域。与ELISA相似，这种测定方法也是基于三明治夹心式技术原理，但该方法是在一种固相支持物上而不是在管子里进行，标记的抗原-抗体复合物侧向迁移，直至遇到在一种固定表面上的抗体。目前市场上已出现了用于侧向流动免疫测定并能用于野外测试的试剂盒。与DNA为基础的检测方法相比，该方法的样品处理简单。由于目标蛋白一般是水溶的且抗体具有高度专一性，因此检测样品仅需要初步处理便能达到测试的要求，具有快速、简便、适合野外操作等优点。

侧向流动免疫测定试纸条可用于检测叶片、种子和谷粒中的转基因成分。侧向流动试纸条被放入少量含有外源蛋白的植物组织抽提物中后，配对抗体与蛋白之间的发生结合形成了三明治形式的复合物，但并不是所有的抗体都与显色试剂相结合。由于膜上具有两个捕获区段，一个捕获外源蛋白结合物，另一个捕获显色试剂。当三明治形式和/或非反应的显色试剂在膜上的特异区段被捕获时，捕获区段显示微红色。若膜上显示单一的一条线（控制线），表明样本是阴性的，若出现两条线，表明样本是阳性的（图3-2）。

与ELISA相比，试纸条检测蛋白也是根据抗原抗体特异性结合的原理，不同之处是以硝化纤维代替聚苯乙烯反应板为固相载体。对外源蛋白特异结合的抗体上联结了显色剂，被固定在试纸条内，当试纸条一端被放入含有外源蛋白的植物组织提取液中，另一端吸水垫的毛细管作用使提取液向上流动，当特异抗体与外源蛋白相结合时，呈现颜色反应。试纸条上含有2个“捕获”区域：1个“捕获”结合外源蛋白的抗体蛋白复合物，另1个“捕获”显色剂。当所形成的夹心复合物及未反应的显色剂被试纸条上的相应“捕获”区捕获时，这些捕获区显红色区带。当在试纸条上只显示1条区带(质控线)时，为阴性结果，表明不含有被检测的转基因蛋白，而当显示2条带时则为阳性结果时则表明含有被检测的转基因蛋白。

美国检测StarLink玉米中的Cry9C蛋白的试纸条已成为美国官方的检测方法。Trait RUR Lateral Flow试剂条可用于检测整合在生物体内的源自根癌农杆菌CP4菌株的基因所表达的CP4-EPSPS蛋白。

侧向流动免疫测定试纸条是一种很快速简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，5～10分钟就可得出结果，不需要特殊仪器和熟练技能。但一种试纸条只能检测一种蛋白质，且只能检测有无存在外源蛋白而不能区分具体的转基因品种。侧向流动免疫测定方法是定性或是半定量。按照合适的采样步骤，可以在给定的一批样品中以99%的置信水平检测出少于0.15%的转基因成分。

3.Western blot 杂交

在基因工程研究中, 经常需要检测外源基因是否能表达，即转录的mRNA能否翻译出特异蛋白质。外源基因表达产物若是酶，可测定该酶活性；若表达产物不具酶活性，就要采用免疫学方法检测，一般采用Western blot杂交。转化的外源基因正常表达时，转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，膜在高浓度的蛋白质（如牛血清白蛋白）溶液中温浴，以封闭非特异性位点。随后步骤同ELISA间接法，即加入目的蛋白的特异性抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的酶标记第二抗体, 最后通过第二抗体上标记化合物的性质进行检测。根据检测结果，可分析出被检植物细胞内目的蛋白表达与否、浓度大小、及大致的分子量。程英豪等以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）外壳蛋白（coat protein，CP）单克隆抗体, 采用Western blot 杂交检测转CMV CP基因的番茄中外源基因的表达情况, 结果表明，在16株具有PCR扩增产

物的转基因植株中有11株表达出CMV CP。

Western blot杂交是植物基因工程中检测外源基因是否表达出蛋白质的权威方法，将蛋白质的电泳、印迹、免疫测定融为一体，具有很高的灵敏性，可以从植物细胞总蛋白中检出50 ng的特异蛋白质，若是提纯的蛋白质，可检出1～5 ng。但其操作较繁琐，费用较高，不适于口岸快速、大量样品的检测。植物病毒检测方法之一为斑点免疫吸附法，与Western blot 杂交相比不同的只是蛋白质样品不经过凝胶电泳，而是直接点在膜上，此方法很适合于大量样品的检测，是否也适用于转基因产品蛋白质的检测还有待试验验证。

基于核酸的转基因产品检测方法