分子生物学 第八章 杂交与芯片技术
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探针标记可以全程标记，亦可对探针的3′端或5′端 进行标记。
探针的体外标记法分为化学法和酶法 ①化学法：利用标记物分子上的活性基因与探针
分子上的基因（如磷酸基因）发生的化学反应， 将标记物直接结合到探针分子上。
探针标记
②酶法标记：预先将放射性同位素或非放射性标 记物连接于NTP或dNTP上，然后利用酶促反应将 标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核 苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。
然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及 纯化该cDNA片段，标记即可。
cDNA探针
也可采用PCR方法扩增。 该方法的优点：双链探针，长度较长，可与靶序列
形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高， 杂交信号强。 缺点是由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过 程中还存在自我复性现象。
4．RNA探针
寡核苷酸探针
③比活度高，适用于大多数杂交。如DNA序列测 定、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交等。
缺点是探针短，特异性差，杂交体稳定性差，杂 交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难 度大，背景噪音也大。
2．基因组DNA探针
基因组DNA经机械剪切或限制性内切酶消化制备 成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当 的学习目标
掌握：1．核酸分子杂交的基本概念。 2．探针的种类与标记方法。 3．常见核酸分子杂交技术的原理。 4．DNA芯片的设计与制备。
熟悉：1．核酸分子杂交信号的检测方法。 了解：1．核酸杂交与DNA芯片技术的应用。
第一节
杂交的基本概念
杂交
杂交（hybridization）是指不同来源的单链核酸， 根据碱基互补配对原则，在适当的条件下形成杂化 双链的过程。
1．缺口平移法 缺口平移法 （nick translation，NT）
是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探 针标记法。
利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的多种酶促活性将 标记的dNTPs掺入新合成DNA链中使探针被 标记。
缺口平移法 缺口平移法 （nick translation，NT）
带缺口的双链DNA均可作为切口平移法的模板。 首先利用DNase I在DNA双链上造成单链切口。 然后利用DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在
利用核酸杂交检测目的核酸的方法称为核酸分子杂 交技术.
核酸杂交是定性或定量检测靶DNA或RNA的方法
探针
探针是指带有标记的单链核酸。 探针能与靶核酸序列互补，可在适当条件下，通过
碱基互补配对的方式与靶核酸序列杂交，再根据标 记信号判断靶核酸序列的位置和含量。
一、核酸分子杂交
核酸杂交是基于核酸变性和复性的特性建立的。 不同种类的单链DNA分子或RNA分子，只要两条
探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、 RNA探针、寡核苷酸探针四大类。
1．寡核苷酸探针
优点是：①制备方便，可根据需要自行设计，避免 了天然核酸探针存在的高度重复序列；②由于寡核 苷酸探针长度只有15～30bp，其中即使有一个碱基 不配对也会显著影响其熔解温度。因此它特别适用 于基因点突变杂交分析；
单链之间存在一定程度的碱基互补配对，就有可 能形成杂化双链（heteroduplex）。
核酸分子杂交
我们把不同来源的单链核酸形成双链的过程称为 核酸分子杂交。
可以是DNA和DNA单链之间杂交，也可以是RNA 和RNA单链间的杂交，甚至可以是DNA单链和 RNA单链之间杂交。
核酸分子杂交
二、探针的类型
切口处将旧链从5′末端逐步切除， 最后，在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶催化下，以
dNTP为底物，在切口的3′末端-OH上合成新的DNA 链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中。
缺口平移法
2．随机引物标记法 （random priming，RP）
随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新 链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5′→3′方向 合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全 互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互 补的DNA链。合成时，带放射性同位素标记的核苷 酸掺入到新合成的DNA分子中。
125I等。以32P应用最普遍。 优点：灵敏度高，可检测到10-18g的物质；有很高的
特异性，假阳性结果较少。 缺点：易造成放射性污染；有同位素半衰期限制。
探针的标记
二是非放射性标记物：如地高辛素、辣根 过氧化酶、碱性磷酸酶等。
优点：是无环境污染、可较长时间贮存。 缺点：是灵敏度不高。
探针标记
基因组DNA探针
因为高度重复序列的存在，可能引起非特异性杂交 而出现假阳性。
优点：制备方法简单，不易降解，标记方法成熟。
3．cDNA探针
由mRNA逆转录而来，在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二 链。将合成的c于DNA的RNA聚合酶 以双链DNA为模板在体外转录而成。
优点：①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。② 单链，不存在变性和自我复性。③RNA中不存在高度 重复序列，非特异性杂交少。④杂交后可用RNase将 未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。
缺点：RNA 提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足量的基因 片段，经适当的标记后，即为基因组DNA探针。
基因组DNA探针
也可采用PCR方法扩增基因组DNA片段，制备基因 组DNA探针。
选择此类探针时要特别注意基因组中存在的高度重 复序列，尽可能使用基因的编码序列（外显子）作 为探针，避免使用内含子及其Βιβλιοθήκη 非编码顺序。三、探针的标记
理想的探针标记物应具备以下特性：①高度 的灵敏性；②不影响 碱基配对的特异性；③ 不影响探针分子的主要理化性质；④对酶促 反应活性无影响；⑤检测方法具有高度灵敏 性和高度特异性。
探针的标记
核酸探针常用的标记物主要有两大类。 一是放射性标记物：如放射性同位素3H、32P、35S、
探针的体外标记法分为化学法和酶法 ①化学法：利用标记物分子上的活性基因与探针
分子上的基因（如磷酸基因）发生的化学反应， 将标记物直接结合到探针分子上。
探针标记
②酶法标记：预先将放射性同位素或非放射性标 记物连接于NTP或dNTP上，然后利用酶促反应将 标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核 苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。
然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及 纯化该cDNA片段，标记即可。
cDNA探针
也可采用PCR方法扩增。 该方法的优点：双链探针，长度较长，可与靶序列
形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高， 杂交信号强。 缺点是由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过 程中还存在自我复性现象。
4．RNA探针
寡核苷酸探针
③比活度高，适用于大多数杂交。如DNA序列测 定、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交等。
缺点是探针短，特异性差，杂交体稳定性差，杂 交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难 度大，背景噪音也大。
2．基因组DNA探针
基因组DNA经机械剪切或限制性内切酶消化制备 成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当 的学习目标
掌握：1．核酸分子杂交的基本概念。 2．探针的种类与标记方法。 3．常见核酸分子杂交技术的原理。 4．DNA芯片的设计与制备。
熟悉：1．核酸分子杂交信号的检测方法。 了解：1．核酸杂交与DNA芯片技术的应用。
第一节
杂交的基本概念
杂交
杂交（hybridization）是指不同来源的单链核酸， 根据碱基互补配对原则，在适当的条件下形成杂化 双链的过程。
1．缺口平移法 缺口平移法 （nick translation，NT）
是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探 针标记法。
利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的多种酶促活性将 标记的dNTPs掺入新合成DNA链中使探针被 标记。
缺口平移法 缺口平移法 （nick translation，NT）
带缺口的双链DNA均可作为切口平移法的模板。 首先利用DNase I在DNA双链上造成单链切口。 然后利用DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在
利用核酸杂交检测目的核酸的方法称为核酸分子杂 交技术.
核酸杂交是定性或定量检测靶DNA或RNA的方法
探针
探针是指带有标记的单链核酸。 探针能与靶核酸序列互补，可在适当条件下，通过
碱基互补配对的方式与靶核酸序列杂交，再根据标 记信号判断靶核酸序列的位置和含量。
一、核酸分子杂交
核酸杂交是基于核酸变性和复性的特性建立的。 不同种类的单链DNA分子或RNA分子，只要两条
探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、 RNA探针、寡核苷酸探针四大类。
1．寡核苷酸探针
优点是：①制备方便，可根据需要自行设计，避免 了天然核酸探针存在的高度重复序列；②由于寡核 苷酸探针长度只有15～30bp，其中即使有一个碱基 不配对也会显著影响其熔解温度。因此它特别适用 于基因点突变杂交分析；
单链之间存在一定程度的碱基互补配对，就有可 能形成杂化双链（heteroduplex）。
核酸分子杂交
我们把不同来源的单链核酸形成双链的过程称为 核酸分子杂交。
可以是DNA和DNA单链之间杂交，也可以是RNA 和RNA单链间的杂交，甚至可以是DNA单链和 RNA单链之间杂交。
核酸分子杂交
二、探针的类型
切口处将旧链从5′末端逐步切除， 最后，在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶催化下，以
dNTP为底物，在切口的3′末端-OH上合成新的DNA 链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中。
缺口平移法
2．随机引物标记法 （random priming，RP）
随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新 链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5′→3′方向 合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全 互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互 补的DNA链。合成时，带放射性同位素标记的核苷 酸掺入到新合成的DNA分子中。
125I等。以32P应用最普遍。 优点：灵敏度高，可检测到10-18g的物质；有很高的
特异性，假阳性结果较少。 缺点：易造成放射性污染；有同位素半衰期限制。
探针的标记
二是非放射性标记物：如地高辛素、辣根 过氧化酶、碱性磷酸酶等。
优点：是无环境污染、可较长时间贮存。 缺点：是灵敏度不高。
探针标记
基因组DNA探针
因为高度重复序列的存在，可能引起非特异性杂交 而出现假阳性。
优点：制备方法简单，不易降解，标记方法成熟。
3．cDNA探针
由mRNA逆转录而来，在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二 链。将合成的c于DNA的RNA聚合酶 以双链DNA为模板在体外转录而成。
优点：①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。② 单链，不存在变性和自我复性。③RNA中不存在高度 重复序列，非特异性杂交少。④杂交后可用RNase将 未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。
缺点：RNA 提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足量的基因 片段，经适当的标记后，即为基因组DNA探针。
基因组DNA探针
也可采用PCR方法扩增基因组DNA片段，制备基因 组DNA探针。
选择此类探针时要特别注意基因组中存在的高度重 复序列，尽可能使用基因的编码序列（外显子）作 为探针，避免使用内含子及其Βιβλιοθήκη 非编码顺序。三、探针的标记
理想的探针标记物应具备以下特性：①高度 的灵敏性；②不影响 碱基配对的特异性；③ 不影响探针分子的主要理化性质；④对酶促 反应活性无影响；⑤检测方法具有高度灵敏 性和高度特异性。
探针的标记
核酸探针常用的标记物主要有两大类。 一是放射性标记物：如放射性同位素3H、32P、35S、