PCR快速检测肠毒素大肠杆菌方法的研究

文章编号:100028020(2009)022*******

・实验研究・

PCR 快速检测肠毒素大肠杆菌方法的研究

李玉锋　代娟　刘红露

1

西华大学生物工程学院,成都　610039

摘要:目的　利用PCR 技术,尝试建立特异性引物PCR 快速检测肠毒素大肠杆菌的方法。方法　设计

肠毒素大肠杆菌LT 基因的特异性引物,优化PCR 反应条件,对16种样品进行细菌通用引物和特异性引物的PCR 扩增,从而鉴定肠毒素大肠杆菌。结果　所有样品都出现细菌通用引物的扩增条带,而只有肠毒素大肠杆菌有特异性引物的PCR 扩增产物,结果与实际完全一致。结论　该方法具有简单、迅速、准确的特点,可应用于对肠毒素大肠杆菌的鉴定。

关键词:PCR 技术　特异性引物　食品检测　大肠杆菌中图分类号:R155151 文献标识码:B

Study on the rapid detection method of Enterotoxigenic E .coli by

polymerase chain reaction technology

LI Yu feng ,DAI Juan ,LIU H onglu

C ollege of Bioengineering ,X ihua University ,Chengdu 610039,China

Abstract :Objective T o establish the rapid detection method of Enterotoxigenic E .coli (ETEC )by polymerase

chain reaction (PCR )technology for characteristic primers.Methods The primer of LT gene from Enterotoxigenic E .coli was designed and the condition of PCR was optimized to identify ETEC with PCR amplification for 16samples.R esults all samples could not be amplified except ETEC with special primer.Conclusion The technology of ETEC determinated by PCR could be easy ,rapid and accurate.

K ey w ords :polymerase chain reaction technology ,characteristic primers Enterotoxigenic E .coli ,food detection

作者简介:李玉峰,男,生物学博士,教授,制药工程系主任

1四川省疾病控制预防中心

肠毒素大肠杆菌((Enterotoxigenic E 1coli ,ETEC )是一种嗜

热、嗜酸、好氧的细菌,能引起肠粘膜细胞水与电解质的代解紊乱,是导致婴幼儿和幼畜腹泻的主要病因之一。ETEC 主要的传染途径是通过食入了被该菌污染的食品所致,因此,快速、准确地检测出食品中的ETEC 就非常重要[1]。目前对

ETEC 的检测方法仍为常规的培养检测法,操作复杂,耗时较长,一般需要4～5天[2]。聚合酶链反应(PCR )技术因具有特

异性强、灵敏度高和快速准确的优点而被广泛应用[3,4]。高特

异性PCR 检测肠毒素大肠杆菌方法的建立和完善为食源性肠毒素大肠杆菌的鉴定,及时控制、防范食品的污染提供了新的途径。

1　材料与方法

111　材料

11111　实验菌株　C83902,C83921肠毒素大肠杆菌购于中国

兽医药品监察所,侵袭性大肠埃希菌购生物制品研究所,其他实验菌株均来源于四川省疾病预防控制中心。11112　主要仪器与试剂　仪器:冷冻高速离心机;PCR 扩增仪(eppendorf m odel 680microplate reader );紫外可见呈像系统;

核酸分析仪E ppendorf AG 22331Hambnry 。

试剂:P M D182T Vector 为宝生物工程(大连)有限公司的产品;T aq DNA 聚合酶为宝信公司的产品;dNTP 与离心柱型高纯度质粒小提取试剂盒由TI AN GE N 公司提供;012ml 薄壁管为Axygen 的产品;其余试剂购于北京赛百盛基因技术有限公司。112　方法11211　菌种的培养及DNA 模板的制备　将菌株接种于20ml LB 液体培养基,37℃震荡过夜培养(150～200r Πmin )。DNA 的

提取采用热裂解法[5]

,取细菌培养液015ml ,置于E ppendorf 管中,2000r Πmin 离心20min ,灭菌蒸馏水洗涤2次,最后用1ml 蒸馏水悬浮,隔水煮沸15min ,8000r Πmin 离心15min ,取上清,即为DNA 模板溶液,保存于-20℃备用。11212　PCR 引物设计　根据G enebank S60731LT 毒素基因序列(1275bp ),选取结构基因内保守区段为目的片段,由软件Express 210设计两对引物(表1)。引物由上海基康生物技术有限公司合成。11213　PCR 反应条件的优化　调整模板、引物和聚合酶浓度以及循环次数和退火温度,用两对设计的特异性引物(P 1、P 2;P 3、P 4)10次进行PCR 扩增。DNA 模板(1μg ΠL )为015μl 、110μl

第37卷　第2期2008年　3月

卫　生　研　究

JOURNA L OF HYGIE NE RESE ARCH

V ol.37　N o.2

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