小鼠皮肤组织HE染色 免疫荧光染色

实验方案小鼠皮肤组织H E染色和免疫荧光染色 HE染色

一试剂及耗材

小鼠皮肤细胞，固定液（4%多聚甲醛），PBS,不同浓度乙醇，透明剂（二甲苯），石蜡，包埋盒，苏木精伊红染色液，中性树胶等

二实验步骤

1.取小鼠皮肤组织去毛处理成合适的大小并置PBS或生理盐水中充分漂洗残余

血液

2.将漂洗干净的组织放入4%多聚甲醛中（1:5的比例浸泡）固定过夜

3.将固定好的组织用PBS清洗两遍，每次30min

4.组织脱水：30%乙醇→50%乙醇→75%乙醇（可4℃过夜）→85%乙醇→95%乙醇

→100%乙醇（各30min）

5.透明：二甲苯透明3×20min（具体时间根据透明程度来设定，小鼠皮肤10min

即透明，透明时如发现组织有部分白雾状，则可能是脱水未脱净）

6.浸蜡：4×30min（每30min换一次蜡，换四次以使石蜡浸入组织起支持作用）

7.包埋（注意组织摆放及横切，纵切，记录标签），待石蜡充分凝固即可修片(刚

包埋好的热蜡块不能立即冷冻)

8.切片（5-7um），摊片（40-45℃），烘片（62℃左右，充分烘干）

9.HE染色：二甲苯Ⅰ(10min) →二甲苯Ⅱ(5min) →二甲苯:乙醇=1:1(2min)→

100%乙醇→95%乙醇(2min)→85%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→50%乙醇(1min)→水(1min)→苏木精染液(1min)→流动自来水(3min)→50%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→85%乙醇(1min)→95%乙醇(1min)→伊红染液(1min)→95%乙醇(1min)

→100%乙醇(1min)→100%乙醇(1min)→二甲苯Ⅰ(2min)→二甲苯Ⅱ(2min)

10.中性树胶封片(注意材料上的二甲苯不能干，尽量避免出现气泡)

11.显微镜观察

三实验样品

四实验结果

免疫荧光染色

一试剂及耗材

小鼠皮肤细胞石蜡切片，山羊血清，一抗，二抗，0.3%Triton x100，PBS等二实验步骤

1.石蜡切片60℃烘片1小时

2.脱蜡到水:二甲苯Ⅰ(10min) →二甲苯Ⅱ(5min) →二甲苯:乙醇=1:1(2min)→100%乙醇→95%乙醇(2min)→85%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→50%乙醇(1min)→水(1min)

3.蒸馏水洗1min

4.抗原修复：切片置于0.1mol/L且ph=6.0的柠檬酸钠修复液中，在水浴锅内（99℃）持续放10-15min，自然冷却20-30分钟（不能将切片拿出冷却）

5.去除内源性酶：3%H2O2室温孵育5-10min

6.PBS洗2-3次，每次5min

7. 0.3%Triton x100室温孵育20min（增加细胞膜通透性）

8.于室温湿盒内非特异血清封闭1h,(用DPBS稀释含10% goat FBS)

9.孵育一抗(ITGB1)4℃过夜或37℃1h（一抗：DPBS(10% goat FBS)=1:200）,注意做空白对照（不加一抗，用DPBS(10% goat FBS)孵育）

10. 孵育完成后PBS洗3次，每次5min

11.滴加荧光二抗（IgG-FITC：DPBS(10% goat FBS)=1:200）室温置湿盒中避光孵育2小时或37℃ 30min，用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS 12.滴加DAPI 避光孵育2分钟（染核）。用PBS 1分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS

13.最后用含10%甘油PBS封片，并在荧光显微镜下立即观察

备注：0.1mol/L 柠檬酸钠PH6.0(柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水中)