遗传性线粒体疾病的生殖细胞基因治疗方法
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卵胞 浆 内单 － － － －◆ 原核形成 ——— — ◆ 囊 胚
启动 Ｐ ｏ ｌ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ偏振 光显 微 镜 成像 系统 及 倒 置显 微 镜加 热 台 ，对 Ｐ ｏ ｌ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ进行 系统 光 路校 正 和 背 景 值 校正 。完成 后 ，将 培 养 皿 置 于 显 微 操 作 系 统 中 ，
开启偏 振 光激 发 ，利 用 持 卵针 旋 转人 类 卵母 细 胞 ，
精子注射
图２ 卵母细胞纺锤体移植后进行
卵胞 浆 内单 精 子注 射 和 胚 胎 培 养
三、治 疗前 景和展 望
可发现 明暗闪烁 的纺锤 体 ，调 整 清 晰度 并 将纺 锤 体
遗 传性线 粒体 疾病 的 生殖 细胞 基 因治疗 的核 心
验相 比 ，人类 卵母 细胞经 过 纺锤 体 转移 后 发 生异 常
的培 养 箱 内培 养 １ ６— １ ８ ｈ ， 倒 置 显 微镜 下 观 察 受 比恒 河猴 卵母 细胞对 这类 操 作更 敏 感 ，与 恒 河猴 实 现象 的机 率 明显 增 高 ，这 可 能是 因为纺 锤 体 转移 操 正常 受精 的胚胎 采用 序 贯 培养 法 培养 至 第 ３天 作导 致 了卵母 细胞染 色体 过 早 分离 、应 该 进 入 到极 或第 ５天 （ 囊胚 ） ，每 日根 据 卵裂 的速 度 、卵裂 球 体的染色体留在卵母细胞 中。虽然大量 的异常受精
Hale Waihona Puke 然剩余双折射性 的残余纺锤体 ，以确认去核是否完
Ｔ ａ ｃ ｈ ｉ ｂ ａ ｎ ａ等 已经 在 非 人 灵 长 类 动 物 恒 河 猴
整 。将 去核后 的人类 卵母 细胞 置于 培养箱 中培养 １ ｈ 研究 中将 一 个 细 胞 的 细 胞 核 转 移 到 另 一 个 细 胞 之
左右，待去核人类卵母细胞 （ 受核卵母细胞 ）的细 中 ，冷冻 复苏后 的恒 河猴 卵母 细 胞 中 的线 粒体 被 替 胞膜 恢 复 。再 次 将 受 核 卵 母 细 胞 置 于 显 微 操 作 仪 换后 经过 Ｉ Ｖ Ｆ ． Ｅ Ｔ导 致 一 只 健 康 的 小 猴 出 生 。这 种
３ ．卵胞 浆 内单精 子注 射 （ ｉ ｎ ｔ ｒ ａ ｃ ｙ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｉ ｃ ｓ ｐ ｅ ｒ ｍ 的基 因组 和受 体 的线粒体 Ｄ Ｎ Ａ，随后 进行 Ｉ Ｃ Ｓ Ｉ ，观
ｉ ｎ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ，Ｉ Ｃ Ｓ Ｉ ）
Ｉ Ｃ Ｓ Ｉ 在 有 加 热 板 的显 微 操 作 仪 下 进 行 。将 实 了这 种 方 法 替 换线 粒 体 Ｄ Ｎ Ａ 的 有 效性 。该 研 究
精子注入含有第 一极 体 的受核 卵母 细胞 胞浆 内， 表 明这 种核 转移 的方法 没有 对 卵母 细胞 产 生不 利 影 受 精 后 的 卵 子 移 入 含 培 养 液 中 ，３ ７ ｃ Ｃ、５ ％Ｃ Ｏ
精情况 。 ４ ．胚胎 培养 和胚胎 移植
响 ，这是 临床转 化 的前 提 条 件 。但 是人 类 卵母 细 胞
上 ，用 注射针 将从 供 核卵 母 细胞 中吸 出 的 ＭＩ Ｉ 期 核 方法 应 用 于 人 类 卵 母 细 胞 中 也 是 可 行 的。 最 近
（ 纺锤体 ）经 透 明带 切 口插 入受 核 卵 母 细 胞 的 透 明 Ｔ ａ ｃ ｈ ｉ ｂ ａ ｎ ａ等 从 研究 志愿者 体 内获得 了 １ ０ ６个 人 卵 带下 ，推 出分离 的纺锤 体 。然 后 ，将 受 核 卵母 细 胞 母 细胞 ，他 们 把 一 个 未 受 精 卵 母 细 胞 的 细 胞 核 移
置于预先制 备 的 Ｇ １ ． ５微 滴 培 养 系 统 中继 续 培 养 除 ，然后 用 另一 个 供 体 卵 母 细 胞 的细 胞 核 代 替 它 。
２ ｈ。
这些交换 含有 线粒 体 的细胞 质 的卵母 细 胞带 有 供 体
察 这些 细胞 能够正 常发 育并 形 成 胚胎 干 细 胞 系 ，证
・
６ Ｏ ・
妇产与遗传 （ 电子版 ） ２ ０ １ ３年 ６月第 ３卷第 ２期 Ｏ ｂ ｓ ｔ ｅ ｔ ｒ ｉ ｃ ｓ － Ｇ ｙ ｎ ｅ ｃ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｓ ， Ｊ ｕ ｎ ｅ ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ， Ｎ ｏ ． ２
ＭⅡ期 人 类 卵 母 细 胞 置 于 培 养 基 中 备 用 。 Ｇ Ｖ及 ＭＩ 期 人 类 卵 母 细 胞 在 体 外 成 熟 培 养 ，约 ２ ４ ｈ后 观 察 是 否 排 出第 一 极 体 ，将 排 出第 一 极 体 的 Ｍ Ⅱ
人 类 卵 母 细 胞 备 用 。人 类 卵 母 细 胞 培 养 箱 的 培 养 条件为 ３ ７℃ 、５ ％Ｃ Ｏ ２ 、５ ％０ ２ 、９ ０ ％Ｎ ２ 和 １ ０ ０ ％ 的湿 度 。 ２ ．供 、受核 卵母 细胞之 间 的纺锤体 移植
置于 ３点钟 位置 ，用 ｚ ｉ ｌ ｏ ｓ 激光 打孔仪 在 ３点 钟位 置 是 进行 卵母 细胞质 的交 换 ，而 纺锤 体 移 植 能够 改 变 的透 明带 上 打 孔 ，使 用 去 核针 （ 内径 １ ８—２ Ｏ ｍ） 几 乎所 有 的细胞 质 ，移 植 的纺 锤体 由受 体 卵母 细 胞 缓慢 吸 出纺锤体 ，在 去核 的过程 中观察 纺 锤体 是 否 质控制 ，因此 这是 改善 卵母 细胞 质 量 的有 效 途 径 ， 在去 核针 内 ，去核完 成后 观 察核 体 内是 否存 在有 双 有望 在临 床治疗 上 用 于母 亲 ｍ ｔ Ｄ Ｎ Ａ突 变体 的遗 传 ， 折射 性 的纺锤体 ，同时观 察 人类 卵 母 细胞 内是 否仍 对有 可能遗 传线 粒体疾 病 的儿童 产生 重要 的影 响 。 。
的形 态和 数量 、碎 片 的多少 对 胚胎 进 行 评分 。胚 胎 限制 了纺锤体转移技术的临床应用 、还需要进一步 转移 以及显微操作的过程均使用 台式加热板及倒 置 的研 究来 解决这 一 问题 ，但 是这 种 方法 为 利 用基 于 显微 镜加 热 台 ，３ ７℃ 下进行 。在 取卵后 第 ３天 或 第 辅 助生殖 技 术 预 防 ｍ ｔ Ｄ Ｎ Ａ疾 病 遗 传 的实 施 提 供 了
启动 Ｐ ｏ ｌ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ偏振 光显 微 镜 成像 系统 及 倒 置显 微 镜加 热 台 ，对 Ｐ ｏ ｌ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ进行 系统 光 路校 正 和 背 景 值 校正 。完成 后 ，将 培 养 皿 置 于 显 微 操 作 系 统 中 ，
开启偏 振 光激 发 ，利 用 持 卵针 旋 转人 类 卵母 细 胞 ，
精子注射
图２ 卵母细胞纺锤体移植后进行
卵胞 浆 内单 精 子注 射 和 胚 胎 培 养
三、治 疗前 景和展 望
可发现 明暗闪烁 的纺锤 体 ，调 整 清 晰度 并 将纺 锤 体
遗 传性线 粒体 疾病 的 生殖 细胞 基 因治疗 的核 心
验相 比 ，人类 卵母 细胞经 过 纺锤 体 转移 后 发 生异 常
的培 养 箱 内培 养 １ ６— １ ８ ｈ ， 倒 置 显 微镜 下 观 察 受 比恒 河猴 卵母 细胞对 这类 操 作更 敏 感 ，与 恒 河猴 实 现象 的机 率 明显 增 高 ，这 可 能是 因为纺 锤 体 转移 操 正常 受精 的胚胎 采用 序 贯 培养 法 培养 至 第 ３天 作导 致 了卵母 细胞染 色体 过 早 分离 、应 该 进 入 到极 或第 ５天 （ 囊胚 ） ，每 日根 据 卵裂 的速 度 、卵裂 球 体的染色体留在卵母细胞 中。虽然大量 的异常受精
Hale Waihona Puke 然剩余双折射性 的残余纺锤体 ，以确认去核是否完
Ｔ ａ ｃ ｈ ｉ ｂ ａ ｎ ａ等 已经 在 非 人 灵 长 类 动 物 恒 河 猴
整 。将 去核后 的人类 卵母 细胞 置于 培养箱 中培养 １ ｈ 研究 中将 一 个 细 胞 的 细 胞 核 转 移 到 另 一 个 细 胞 之
左右，待去核人类卵母细胞 （ 受核卵母细胞 ）的细 中 ，冷冻 复苏后 的恒 河猴 卵母 细 胞 中 的线 粒体 被 替 胞膜 恢 复 。再 次 将 受 核 卵 母 细 胞 置 于 显 微 操 作 仪 换后 经过 Ｉ Ｖ Ｆ ． Ｅ Ｔ导 致 一 只 健 康 的 小 猴 出 生 。这 种
３ ．卵胞 浆 内单精 子注 射 （ ｉ ｎ ｔ ｒ ａ ｃ ｙ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｉ ｃ ｓ ｐ ｅ ｒ ｍ 的基 因组 和受 体 的线粒体 Ｄ Ｎ Ａ，随后 进行 Ｉ Ｃ Ｓ Ｉ ，观
ｉ ｎ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ，Ｉ Ｃ Ｓ Ｉ ）
Ｉ Ｃ Ｓ Ｉ 在 有 加 热 板 的显 微 操 作 仪 下 进 行 。将 实 了这 种 方 法 替 换线 粒 体 Ｄ Ｎ Ａ 的 有 效性 。该 研 究
精子注入含有第 一极 体 的受核 卵母 细胞 胞浆 内， 表 明这 种核 转移 的方法 没有 对 卵母 细胞 产 生不 利 影 受 精 后 的 卵 子 移 入 含 培 养 液 中 ，３ ７ ｃ Ｃ、５ ％Ｃ Ｏ
精情况 。 ４ ．胚胎 培养 和胚胎 移植
响 ，这是 临床转 化 的前 提 条 件 。但 是人 类 卵母 细 胞
上 ，用 注射针 将从 供 核卵 母 细胞 中吸 出 的 ＭＩ Ｉ 期 核 方法 应 用 于 人 类 卵 母 细 胞 中 也 是 可 行 的。 最 近
（ 纺锤体 ）经 透 明带 切 口插 入受 核 卵 母 细 胞 的 透 明 Ｔ ａ ｃ ｈ ｉ ｂ ａ ｎ ａ等 从 研究 志愿者 体 内获得 了 １ ０ ６个 人 卵 带下 ，推 出分离 的纺锤 体 。然 后 ，将 受 核 卵母 细 胞 母 细胞 ，他 们 把 一 个 未 受 精 卵 母 细 胞 的 细 胞 核 移
置于预先制 备 的 Ｇ １ ． ５微 滴 培 养 系 统 中继 续 培 养 除 ，然后 用 另一 个 供 体 卵 母 细 胞 的细 胞 核 代 替 它 。
２ ｈ。
这些交换 含有 线粒 体 的细胞 质 的卵母 细 胞带 有 供 体
察 这些 细胞 能够正 常发 育并 形 成 胚胎 干 细 胞 系 ，证
・
６ Ｏ ・
妇产与遗传 （ 电子版 ） ２ ０ １ ３年 ６月第 ３卷第 ２期 Ｏ ｂ ｓ ｔ ｅ ｔ ｒ ｉ ｃ ｓ － Ｇ ｙ ｎ ｅ ｃ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｓ ， Ｊ ｕ ｎ ｅ ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ， Ｎ ｏ ． ２
ＭⅡ期 人 类 卵 母 细 胞 置 于 培 养 基 中 备 用 。 Ｇ Ｖ及 ＭＩ 期 人 类 卵 母 细 胞 在 体 外 成 熟 培 养 ，约 ２ ４ ｈ后 观 察 是 否 排 出第 一 极 体 ，将 排 出第 一 极 体 的 Ｍ Ⅱ
人 类 卵 母 细 胞 备 用 。人 类 卵 母 细 胞 培 养 箱 的 培 养 条件为 ３ ７℃ 、５ ％Ｃ Ｏ ２ 、５ ％０ ２ 、９ ０ ％Ｎ ２ 和 １ ０ ０ ％ 的湿 度 。 ２ ．供 、受核 卵母 细胞之 间 的纺锤体 移植
置于 ３点钟 位置 ，用 ｚ ｉ ｌ ｏ ｓ 激光 打孔仪 在 ３点 钟位 置 是 进行 卵母 细胞质 的交 换 ，而 纺锤 体 移 植 能够 改 变 的透 明带 上 打 孔 ，使 用 去 核针 （ 内径 １ ８—２ Ｏ ｍ） 几 乎所 有 的细胞 质 ，移 植 的纺 锤体 由受 体 卵母 细 胞 缓慢 吸 出纺锤体 ，在 去核 的过程 中观察 纺 锤体 是 否 质控制 ，因此 这是 改善 卵母 细胞 质 量 的有 效 途 径 ， 在去 核针 内 ，去核完 成后 观 察核 体 内是 否存 在有 双 有望 在临 床治疗 上 用 于母 亲 ｍ ｔ Ｄ Ｎ Ａ突 变体 的遗 传 ， 折射 性 的纺锤体 ，同时观 察 人类 卵 母 细胞 内是 否仍 对有 可能遗 传线 粒体疾 病 的儿童 产生 重要 的影 响 。 。
的形 态和 数量 、碎 片 的多少 对 胚胎 进 行 评分 。胚 胎 限制 了纺锤体转移技术的临床应用 、还需要进一步 转移 以及显微操作的过程均使用 台式加热板及倒 置 的研 究来 解决这 一 问题 ，但 是这 种 方法 为 利 用基 于 显微 镜加 热 台 ，３ ７℃ 下进行 。在 取卵后 第 ３天 或 第 辅 助生殖 技 术 预 防 ｍ ｔ Ｄ Ｎ Ａ疾 病 遗 传 的实 施 提 供 了