基因工程的基本工具
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16:40——17：40
现代生物科学技术专题
基因工程
专题一
第1部分：
基础理论和技术发展
早期基础理论
01
02
03
1859年达尔文提出生物进化论 1900年孟德尔基因分离定律和自
由组合定律的再度提出
1910年摩尔根证明基因在染色体 上，并提出基因的连锁互换定律
1944年艾弗里证明 DNA是遗传物质。
后期基础理论
1958年梅塞尔松、斯 塔尔证明DNA的半保 留复制
1963年尼伦伯格和马 太破译编码氨基酸的 遗传密码，1966年霍 拉纳用实验加以证明 。
1953年沃森、克里克 提出DNA的双螺旋结 构模型
1958年克里克等提出 中心法则
技术发明
1967年基因转移载体的发现 1970年工具酶的发现
1965年氨基酸测序和1977年DNA 测序技术的发明
1972年DNA体外重组的实现 1973年重组DNA表达实验的成功 1980年第一例转基因动物问世
1983年第一例转基因植物问世 1988年PCR技术的发明
第2部分：
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗 传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设 计和施工的。因此又叫做DNA重组技术。
质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
第4部分：
预习高频错题再练
第5部分：
重组DNA分子的模拟操作
T4DNA连接酶
【点拨】限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作 用部位二者都作用于 DNA分子中脱氧核苷酸间 的磷酸二酯键,而不是碱基对之间的氢键， 即 作用于DNA双螺旋结构的“扶手”,而不是“楼梯”。
DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA 的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可 以连接单链DNA的酶。
⒉常用运载体：
⑴ 质粒【常用】 ⑵ 动植物病毒 ⑶ λ噬菌体的衍生物
限制酶
主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键 产生黏末端或平末端
DNA连接酶
连接磷酸二酯键
种类
E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶
载体
具备的条件
具一种至多种限制酶切点 能在宿主细胞中自我复制 具标记基因
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? DNA连接酶
DNA聚合酶
……… …… …… …… …… ……… …… ……
……
DNA
母链
A A T C T A T AG
T T A G AT AT C
A DNA聚合酶 C
A
DNA聚合酶
DNA连接酶
连接 对象
1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片 1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯
思考?
手术刀
限制性核 酸内切酶
3.限制酶的作用结果
• （1）限制性核酸内切酶能够识别和切割DNA和RNA中 的磷酸二酯键。（ ）
• （2）限制性核酸内切酶能催化DNA中所有的磷酸二酯 键的水解。（ ）
手术刀 限制性核 酸内切酶
将不同种来源的DNA片段连接起来成为可能
1.作用:
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键
段上，形成磷酸二酯键
键
是否需 要模板
2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸 通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA 链
2)能将DNA双链上的两个缺口同时 连接起来，不需要模板
相同点
形成磷酸二酯键
如图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生下列变化，则X 酶是（ ）
A.DNA连接酶 C.DNA聚合酶
思考?
手术刀
限制性核 酸内切酶
3.限制酶的作用结果
• 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分 子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基 化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其 切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的 DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
手术刀 限制性核 酸内切酶
• 想一想——限制酶所识别的序列有什么特点？
限制酶所识别的序列，无论是6 个碱基还是4个碱基，都可以找 到一条中心轴线（如图），中 轴线两侧的双链DNA上的碱基 是反向、对称、重复排列的。
手术刀
限制性核 酸内切酶
3.限制酶的作用结果
平末端
黏性末端
思考?
手术刀
限制性核 酸内切酶
01
02
03
04
基因工程别名
DNA重组技术
05
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基因工程的实质
基因重组
通过基因工程使生物产生新性状， 属于可遗传变异中的哪一种类型？ 基因工程属于广义的基因重组。
第3部分：
基因工程的基本工具
运载体
手术刀
限制性核 酸内切酶
基因工程 三大工具
DNA连接酶
3.限制酶的作用结果
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切 口？可产生几个黏性(平)末端？
要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。
思考?
手术刀
限制性核 酸内切酶
3.限制酶的作用结果
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会 怎样呢？
会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末 端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。
来自百度文库
2.种类:
类型
E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶
来源
相同点
功能 差别
大肠杆菌 T4噬菌体
恢复磷酸 二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端( 效率较低)
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
质粒的本质：
质粒是一种裸露的、結杓簡単、独立于 细菌拟核DNA之外,井具有自我复制能 力的很小的双链环状DNA分子。
有标记基因的存在，可用含 氨苄青霉素的培养基鉴别
有切割位点
能复制并带着插入的目的基因 一起复制
作为载体必需具备的条件：
⑴有一至多个限制酶切点 ⑵对受体细胞无害 ⑶能在受体细胞中自我复制 ⑷带有某些标记基因，便于筛选
B.RNA聚合酶 D.限制性核酸内切酶
3.我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。获得耐盐基因后，为了构 建重组DNA分子，在此过程中DNA连接酶作用的位点及相应的化学键为（ ）
A. a、磷酸二酯键 C. a、氢键
B. b、氢键 D. b、磷酸二酯键
【探寻规律】
几种酶的作用部位
限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶作 用于 ① 部位,DNA解旋酶作用于 ② 部位。
手术刀 限制性核 酸内切酶
⒈主要来源： 原核生物 2.作用特点： 识别特定核苷酸序列,切断两个核苷酸之间的
磷酸二酯键。
具有特异性。一种限制酶一 般只能识别一种特定的核苷 酸序列，并且能在特定的切 点上切割DNA分子。
限制酶就是细菌的一种防御 性工具，切割外源DNA、使 之失效，从而达到保护自身 的目的。
现代生物科学技术专题
基因工程
专题一
第1部分：
基础理论和技术发展
早期基础理论
01
02
03
1859年达尔文提出生物进化论 1900年孟德尔基因分离定律和自
由组合定律的再度提出
1910年摩尔根证明基因在染色体 上，并提出基因的连锁互换定律
1944年艾弗里证明 DNA是遗传物质。
后期基础理论
1958年梅塞尔松、斯 塔尔证明DNA的半保 留复制
1963年尼伦伯格和马 太破译编码氨基酸的 遗传密码，1966年霍 拉纳用实验加以证明 。
1953年沃森、克里克 提出DNA的双螺旋结 构模型
1958年克里克等提出 中心法则
技术发明
1967年基因转移载体的发现 1970年工具酶的发现
1965年氨基酸测序和1977年DNA 测序技术的发明
1972年DNA体外重组的实现 1973年重组DNA表达实验的成功 1980年第一例转基因动物问世
1983年第一例转基因植物问世 1988年PCR技术的发明
第2部分：
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗 传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设 计和施工的。因此又叫做DNA重组技术。
质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
第4部分：
预习高频错题再练
第5部分：
重组DNA分子的模拟操作
T4DNA连接酶
【点拨】限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作 用部位二者都作用于 DNA分子中脱氧核苷酸间 的磷酸二酯键,而不是碱基对之间的氢键， 即 作用于DNA双螺旋结构的“扶手”,而不是“楼梯”。
DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA 的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可 以连接单链DNA的酶。
⒉常用运载体：
⑴ 质粒【常用】 ⑵ 动植物病毒 ⑶ λ噬菌体的衍生物
限制酶
主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键 产生黏末端或平末端
DNA连接酶
连接磷酸二酯键
种类
E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶
载体
具备的条件
具一种至多种限制酶切点 能在宿主细胞中自我复制 具标记基因
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? DNA连接酶
DNA聚合酶
……… …… …… …… …… ……… …… ……
……
DNA
母链
A A T C T A T AG
T T A G AT AT C
A DNA聚合酶 C
A
DNA聚合酶
DNA连接酶
连接 对象
1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片 1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯
思考?
手术刀
限制性核 酸内切酶
3.限制酶的作用结果
• （1）限制性核酸内切酶能够识别和切割DNA和RNA中 的磷酸二酯键。（ ）
• （2）限制性核酸内切酶能催化DNA中所有的磷酸二酯 键的水解。（ ）
手术刀 限制性核 酸内切酶
将不同种来源的DNA片段连接起来成为可能
1.作用:
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键
段上，形成磷酸二酯键
键
是否需 要模板
2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸 通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA 链
2)能将DNA双链上的两个缺口同时 连接起来，不需要模板
相同点
形成磷酸二酯键
如图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生下列变化，则X 酶是（ ）
A.DNA连接酶 C.DNA聚合酶
思考?
手术刀
限制性核 酸内切酶
3.限制酶的作用结果
• 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分 子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基 化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其 切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的 DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
手术刀 限制性核 酸内切酶
• 想一想——限制酶所识别的序列有什么特点？
限制酶所识别的序列，无论是6 个碱基还是4个碱基，都可以找 到一条中心轴线（如图），中 轴线两侧的双链DNA上的碱基 是反向、对称、重复排列的。
手术刀
限制性核 酸内切酶
3.限制酶的作用结果
平末端
黏性末端
思考?
手术刀
限制性核 酸内切酶
01
02
03
04
基因工程别名
DNA重组技术
05
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基因工程的实质
基因重组
通过基因工程使生物产生新性状， 属于可遗传变异中的哪一种类型？ 基因工程属于广义的基因重组。
第3部分：
基因工程的基本工具
运载体
手术刀
限制性核 酸内切酶
基因工程 三大工具
DNA连接酶
3.限制酶的作用结果
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切 口？可产生几个黏性(平)末端？
要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。
思考?
手术刀
限制性核 酸内切酶
3.限制酶的作用结果
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会 怎样呢？
会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末 端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。
来自百度文库
2.种类:
类型
E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶
来源
相同点
功能 差别
大肠杆菌 T4噬菌体
恢复磷酸 二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端( 效率较低)
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
质粒的本质：
质粒是一种裸露的、結杓簡単、独立于 细菌拟核DNA之外,井具有自我复制能 力的很小的双链环状DNA分子。
有标记基因的存在，可用含 氨苄青霉素的培养基鉴别
有切割位点
能复制并带着插入的目的基因 一起复制
作为载体必需具备的条件：
⑴有一至多个限制酶切点 ⑵对受体细胞无害 ⑶能在受体细胞中自我复制 ⑷带有某些标记基因，便于筛选
B.RNA聚合酶 D.限制性核酸内切酶
3.我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。获得耐盐基因后，为了构 建重组DNA分子，在此过程中DNA连接酶作用的位点及相应的化学键为（ ）
A. a、磷酸二酯键 C. a、氢键
B. b、氢键 D. b、磷酸二酯键
【探寻规律】
几种酶的作用部位
限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶作 用于 ① 部位,DNA解旋酶作用于 ② 部位。
手术刀 限制性核 酸内切酶
⒈主要来源： 原核生物 2.作用特点： 识别特定核苷酸序列,切断两个核苷酸之间的
磷酸二酯键。
具有特异性。一种限制酶一 般只能识别一种特定的核苷 酸序列，并且能在特定的切 点上切割DNA分子。
限制酶就是细菌的一种防御 性工具，切割外源DNA、使 之失效，从而达到保护自身 的目的。