第六讲典型生物催化的反应-氧化还原反应剖析
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1、分子相对不稳定 2、价格昂贵（化学计量的数量） 反应中辅酶仅仅是其氧化还原状态发生变 化，因此可以用另外一个氧化还原反应进行 原位（in situ）再生。 需要加入催化计量的辅酶，降低费用
• 辅酶重复利用性能的表征
TTN（Total turnover number） 总转换数：代表循环过程的效率 即：在一个完整的反应过程中每mol辅酶可
• G6PDH也可以用于同样的反应体系 • 从Leuconostoc mesenteroides肠链球菌中
提取的酶廉价，稳定，可以NAD(P)＋为底 物，而酵母中的G6PDH仅以为NADP＋底物
• 缺点：G6P价格昂贵 • 解决方法：用己糖激酶从葡萄糖利用酶法
制取，但是又涉及到ATP的再生
• 可以使用6-硫酸-葡萄糖和从酿酒酵母中提
X R1
X
or
H R3
R2 H
Chiral products
辅酶的再生
• 氧化还原酶的催化特点
氧化还原酶需要氧化还原辅酶，提供（或 接受）还原（或氧化）反应中的化学平衡 物质。
• 辅酶的类型
NAD（H）：80％ NADP（H）：10％ 黄素（FMN，FAD）和吡咯喹啉醌（PQQ） 比较少
• 辅酶的特点
3、FDH有商品酶供应，容易进行固 定化，稳定
• 缺点：FDH价格昂贵，比活较低（3U/mg）
固定化FDH可以解决上述问题
• 最广泛使用再生NADH的方法 • TTN：103～105，但是不能用于NADPH的再生
葡萄糖脱氢酶法：NAD(P)H的再生
• 酶：GDH（Glucose dehydrogenase）
以产生的产物的总mol数。 辅酶分子会在循环过程中受到破坏 一般TTN需要达到103～104，对于大规模生 产，最好能够达到105。
• 还原反应技术应用的“瓶颈”
辅酶的价格（大规模反应） 认识问题——深入研究——解决问题
当使用完整的微生物细胞作用生物催化剂 时，辅酶的再生不再是一个关键问题。
微生物含有代谢过程中所需的所有酶和辅 酶。通过加入象糖类这些廉价易得的氧化还 原平衡物质可以进行辅酶的再生。
氧化还原反应
• 氧化还原酶
Redox Enzyme 主要包括三种酶： 1、脱氢酶（Dehydrogenase） 2、加氧酶（Oxygenase） 3、氧化酶（Oxidase）
1 还原反应
• 脱氢酶广泛用于醛或者酮等羰基和C＝C键
的还原反应
• 根据底物的取代方式，这两个反应都会由
具有不对称潜力的潜手性底物生产手性产 物
• 其逆过程（反应）如醇的氧化或者脱氢反
应通常会伴随着手性中心的破坏，因而限 制了它的应用
脱氢酶催化的还原反应
O
OH
OH
R1 R1
Dehydrogenase
R2
R1
R2 or R1
R2
X Cofactor-H2
Cofactor
R2 H
H R3
R2
R3
Prochiral substrate
Recycling System R1
取的G6PDH再生NADPH。硫酸不会作为酸 催化剂水解NADPH，且底物比磷酸盐容易 制备。
• 作为Glucose/GDH方法的补充，是再生
NADH和NADPH的比较好的方法
乙醇脱氢酶和醇脱氢酶法
• 乙醇脱氢酶（Ethanol DH） • 醇脱氢酶（Alcohol DH）
酵母中：NADH L. mesenteroides：NADPH
HO HO
OR
OR
GDH( R=H )
O
Glucose-6-P DH( R=P ) HO
O
OH
HO
O
OH
NAD(P)+
NAD(P)H
OH
spontaneous
HO HO
OR OH CO2H OH
• 特点：从Bacillus cereus中提取的GDH很稳
定，比活较高
• 缺点：1、GDH价格昂贵
2、产物分离困难 如果不考虑纯化问题，此法在实验室中应 用是一个很好的方法，也是再生NADPH的最 简单的方法之一
还原性尼克酰胺辅酶的再生
1、非酶的化学还原
NAD+
Leabharlann Baidu
NADH
比如用Na2S2O4 TTN≤100，简单，效率较低
酶会由于Na2S2O4而引起失活
2、电化学、光化学再生 优点：价格低廉，易于使用 缺点：反应区域控制性差，副反应多 TTN≤1000
3、酶法还原NADH和NADPH 高效，复杂，费用高
酶法还原再生
• 底物偶联法
Subtrate
Substrate-H2
NAD(P)H
Single Enzyme
NAD(P)+
Auxiliary
subtrate (乙醛等)
Auxiliary Subtrate-H2
• 方法：辅酶的再生是通过加入一种辅助底
物（Donor，供体），在同一种酶的 作用下，向相反的方向进行反应。 为使反应平衡向所期望的方向进行， 供体通常是过量的，TTN≥103
Alcohol DH EtOH
Aldehyde DH CH3-CH=O
CH3-COO-
NAD(P)+ NAD(P)H
NAD+
NADH
• 广泛用于NADH和NADPH的再生 • 优点：1、ADH价格适中
2、乙醇、乙醛有挥发性
• 缺点：1、只有醛或者环酮这样有活性羰基
• 缺点：1、增加了产物纯化难度
2、供体的加入可能引起酶的失活 3、辅助底物浓度高，引起底物抑制 可以考虑使用气膜等进行反应与分离耦合
• 酶偶联法
Subtrate
Enzyme A
Substrate-H2
NAD(P)H
NAD(P)+
Auxiliary
subtrate (乙醛等)
Enzyme B
Auxiliary Subtrate-H2
广泛应用，各有优缺点。
• NADPH仅在实验室规模进行再生，对于大
规模生产尚需开始一种廉价高效的方法
FDH法：NADH的再生
• 酶：Formate Dehydrogenase
FDH
H-COO-
CO2
NAD+ NADH
• 优点：1、辅助底物和副产物对酶没有抑制
作用
2、辅助底物和副产物容易和产物进 行分离
• 方法：两个平行的氧化还原反应，分别由
两种不同的酶催化主要底物和辅酶 再生的转化过程。
• 特点：两个酶对各自的底物有足够的专一
性，使两个酶反应可以各自独立进 行。所有的底物和辅助底物不会竞 争某一个酶的活性中心，反应效率 较高，各自独立进行转化 需要加入另外一种酶
• NADH有一些进行再生的好方法，已经获得
• 辅酶重复利用性能的表征
TTN（Total turnover number） 总转换数：代表循环过程的效率 即：在一个完整的反应过程中每mol辅酶可
• G6PDH也可以用于同样的反应体系 • 从Leuconostoc mesenteroides肠链球菌中
提取的酶廉价，稳定，可以NAD(P)＋为底 物，而酵母中的G6PDH仅以为NADP＋底物
• 缺点：G6P价格昂贵 • 解决方法：用己糖激酶从葡萄糖利用酶法
制取，但是又涉及到ATP的再生
• 可以使用6-硫酸-葡萄糖和从酿酒酵母中提
X R1
X
or
H R3
R2 H
Chiral products
辅酶的再生
• 氧化还原酶的催化特点
氧化还原酶需要氧化还原辅酶，提供（或 接受）还原（或氧化）反应中的化学平衡 物质。
• 辅酶的类型
NAD（H）：80％ NADP（H）：10％ 黄素（FMN，FAD）和吡咯喹啉醌（PQQ） 比较少
• 辅酶的特点
3、FDH有商品酶供应，容易进行固 定化，稳定
• 缺点：FDH价格昂贵，比活较低（3U/mg）
固定化FDH可以解决上述问题
• 最广泛使用再生NADH的方法 • TTN：103～105，但是不能用于NADPH的再生
葡萄糖脱氢酶法：NAD(P)H的再生
• 酶：GDH（Glucose dehydrogenase）
以产生的产物的总mol数。 辅酶分子会在循环过程中受到破坏 一般TTN需要达到103～104，对于大规模生 产，最好能够达到105。
• 还原反应技术应用的“瓶颈”
辅酶的价格（大规模反应） 认识问题——深入研究——解决问题
当使用完整的微生物细胞作用生物催化剂 时，辅酶的再生不再是一个关键问题。
微生物含有代谢过程中所需的所有酶和辅 酶。通过加入象糖类这些廉价易得的氧化还 原平衡物质可以进行辅酶的再生。
氧化还原反应
• 氧化还原酶
Redox Enzyme 主要包括三种酶： 1、脱氢酶（Dehydrogenase） 2、加氧酶（Oxygenase） 3、氧化酶（Oxidase）
1 还原反应
• 脱氢酶广泛用于醛或者酮等羰基和C＝C键
的还原反应
• 根据底物的取代方式，这两个反应都会由
具有不对称潜力的潜手性底物生产手性产 物
• 其逆过程（反应）如醇的氧化或者脱氢反
应通常会伴随着手性中心的破坏，因而限 制了它的应用
脱氢酶催化的还原反应
O
OH
OH
R1 R1
Dehydrogenase
R2
R1
R2 or R1
R2
X Cofactor-H2
Cofactor
R2 H
H R3
R2
R3
Prochiral substrate
Recycling System R1
取的G6PDH再生NADPH。硫酸不会作为酸 催化剂水解NADPH，且底物比磷酸盐容易 制备。
• 作为Glucose/GDH方法的补充，是再生
NADH和NADPH的比较好的方法
乙醇脱氢酶和醇脱氢酶法
• 乙醇脱氢酶（Ethanol DH） • 醇脱氢酶（Alcohol DH）
酵母中：NADH L. mesenteroides：NADPH
HO HO
OR
OR
GDH( R=H )
O
Glucose-6-P DH( R=P ) HO
O
OH
HO
O
OH
NAD(P)+
NAD(P)H
OH
spontaneous
HO HO
OR OH CO2H OH
• 特点：从Bacillus cereus中提取的GDH很稳
定，比活较高
• 缺点：1、GDH价格昂贵
2、产物分离困难 如果不考虑纯化问题，此法在实验室中应 用是一个很好的方法，也是再生NADPH的最 简单的方法之一
还原性尼克酰胺辅酶的再生
1、非酶的化学还原
NAD+
Leabharlann Baidu
NADH
比如用Na2S2O4 TTN≤100，简单，效率较低
酶会由于Na2S2O4而引起失活
2、电化学、光化学再生 优点：价格低廉，易于使用 缺点：反应区域控制性差，副反应多 TTN≤1000
3、酶法还原NADH和NADPH 高效，复杂，费用高
酶法还原再生
• 底物偶联法
Subtrate
Substrate-H2
NAD(P)H
Single Enzyme
NAD(P)+
Auxiliary
subtrate (乙醛等)
Auxiliary Subtrate-H2
• 方法：辅酶的再生是通过加入一种辅助底
物（Donor，供体），在同一种酶的 作用下，向相反的方向进行反应。 为使反应平衡向所期望的方向进行， 供体通常是过量的，TTN≥103
Alcohol DH EtOH
Aldehyde DH CH3-CH=O
CH3-COO-
NAD(P)+ NAD(P)H
NAD+
NADH
• 广泛用于NADH和NADPH的再生 • 优点：1、ADH价格适中
2、乙醇、乙醛有挥发性
• 缺点：1、只有醛或者环酮这样有活性羰基
• 缺点：1、增加了产物纯化难度
2、供体的加入可能引起酶的失活 3、辅助底物浓度高，引起底物抑制 可以考虑使用气膜等进行反应与分离耦合
• 酶偶联法
Subtrate
Enzyme A
Substrate-H2
NAD(P)H
NAD(P)+
Auxiliary
subtrate (乙醛等)
Enzyme B
Auxiliary Subtrate-H2
广泛应用，各有优缺点。
• NADPH仅在实验室规模进行再生，对于大
规模生产尚需开始一种廉价高效的方法
FDH法：NADH的再生
• 酶：Formate Dehydrogenase
FDH
H-COO-
CO2
NAD+ NADH
• 优点：1、辅助底物和副产物对酶没有抑制
作用
2、辅助底物和副产物容易和产物进 行分离
• 方法：两个平行的氧化还原反应，分别由
两种不同的酶催化主要底物和辅酶 再生的转化过程。
• 特点：两个酶对各自的底物有足够的专一
性，使两个酶反应可以各自独立进 行。所有的底物和辅助底物不会竞 争某一个酶的活性中心，反应效率 较高，各自独立进行转化 需要加入另外一种酶
• NADH有一些进行再生的好方法，已经获得