有关基因工程抗体的研究

基因工程抗体及其研制技术的研究摘要：抗体在疾病诊断、治疗和预防中发挥着重要作用, 随着基因技术，分子生物学，分子免疫学的飞速发展,基因工程抗体以及在此基础上的各种制备技术的出现和发展, 使抗体的制备更加简单有效, 应用前景更加广阔。

关键词:抗体 基因工程抗体 制备技术

Research on the genetic engineering antibodies and their preparation technology Abstract:Antibodies play an important role in disease diagnosis,treatment and prevention . With the rapid development of gene technology, molecular biology, molecular immunology ,the emergence and development of genetic engineering antibodies and various preparation techniques, the antibody preparation become easier and more efficient, more broad application prospects .

Keyword：antibodies genetic engineering antibodies preparation technology

1基因工程抗体概述

抗体应用于医学领域已经有很久的历史了, 自19世纪末用免疫动物获得抗血清以来, 这种途径一直是获得抗体的经典方法。基因工程抗体是指应用DNA重组和蛋白质工程技术,在基因水平对抗体进行切割,拼接或修饰,重新组装成的新型抗体分子[1]。基本原理是, 首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA, 逆转录成cDNA, 再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因, 按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中, 并在适当的细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子, 筛选出高表达的细胞株, 再用亲和层析等手段纯化抗体片段[2]。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点[3]。

2基因工程抗体分类

2.1人源化的基因工程抗体

人们早期曾尝试用人杂交瘤细胞来生产人单克隆抗体，但是由于人杂交瘤细胞的不稳定性，人单克隆抗体的低亲和力和伦理争议等方面的原因导致该技术很少被应用[4]。随着基因工程技术的发展人们更多的应用基因工程技术手段来对鼠源抗体进行改进来生产人源抗体。 1997年FDA 批准第一株人源化抗体上市。2002年，阿达利单抗(Adalimumab)成为第

一个被美国FDA批准的治疗性人源单抗，随后一批人源抗体相继被开发[5]。1986-2012年，美国FDA或欧洲已批准了34个治疗性抗体上市。2012年3月，我国第一个治疗性人源化单克隆抗体尼妥珠单抗临床应用研讨会在古巴举行[6]。

2.1.1嵌合抗体

降低鼠源单克隆抗体免疫原性的一种方法是将鼠免疫球蛋白的可变区部分链接到相应的人免疫球蛋白的恒定区[7]，这样就产生了鼠/人嵌合抗体，人源区域在 60% 70% 应用重组 DNA 技术，将鼠源单抗的可变区基因与人的恒定区基因连接，构建的嵌合基因插入适当的表达质粒，转染相应的细胞后表达所产生的嵌合抗体具有结合抗原的功能，同时降低了鼠源单抗的异源性。

2.1.2人化抗体

为了降低嵌合抗体的免疫原性，使嵌合抗体更加人源化，产生了 CDR 嫁接技术[8]。该技术将免疫球蛋白的其他区域都用人免疫球蛋白取代，而仅仅保留鼠免疫球蛋白可变区的 CDR 部分，这就最大限度地降低鼠源抗体的免疫原性这样产生的抗体叫做人化抗体[9]。

2.2小分子抗体

小分子抗体以表达抗体轻重链可变区基因为主, 含或不含外源肽链的分子较小的抗体片段, 以分子小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注。主要包括单链抗体、双特异性抗体、二硫键抗体、抗体Fab段、单域抗体(single domain antibody, SDA)、三链抗体(triabody)、抗体F(ab)2等[10]。

3 基因工程抗体研制技术

3.1 抗体基因组合文库技术

　抗体基因组合文库技术简单地说就是利用抗体基因噬菌体库代替B 细胞克隆来表达抗体库 。因此抗体基因组合文库技术也称为噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，使抗体工程进入了一个全新的时期．利用基因工程的方法克隆全套抗体可变区基因并在噬菌体表面表达，得到多样性噬菌体抗体的集合即噬菌体抗体库，通过“吸附—洗脱—扩增”的富集过程，可有效地从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体的可变区基因．其原理以噬菌体为载体，将抗体基因与噬菌体编码的外壳蛋白Ⅲ（cpⅢ）或cpⅧ相连，在噬菌体表面以抗体——外壳蛋白融合蛋白的形式表达，经辅助病毒感染后，借助cpⅢ的信号肽穿膜作用，进入宿主外周基质，在正确折叠后被包装于噬菌体尾部，随后携带表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段的噬菌体颗粒．此抗体可以特异性识别抗原，又能够感染宿主菌进行再扩增，将B

细胞全套可变区基因克隆出来，组装成噬菌体抗体的群体，则为噬菌体抗体库技术[11]。其成功主要依赖以下三项技术 : PCR 技术,免疫球蛋白 Fab 片段在大肠杆菌中的成功表达, 噬菌体表面展示文库技术的建立[12]。

1990年McCAffery等首次证明抗体DNA片段可在噬菌体表面展示[13]，随后利用噬菌体来进行基因工程抗体的研究取得了长足的进展 噬菌体展示抗体技术是将通过PCR扩增出淋巴细胞中整套编码人抗体的基因序列，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面，再通过表型筛选确定抗体的基因型，并利用噬菌体的DNA突变特性获得大量的突变体，再通过基因工程技术获得特异的全人源化抗体利用这一技术目前已成功构建了多个不同类型的scFv，Fab和sdAb抗体文库，用于人源化抗体的研究开发[14]。该技术能够绕过免疫动物和细胞融合等过程，并能通过抗体片段的克隆选择，理论上能够分离得到几乎所有抗原的人源性抗体，但在实际研究过程中，抗体的亲合力和抗体库的容量问题是影响噬菌体展示技术应用的重要因素[15]。

3.2核 糖 体 展 示 技 术 (ribosome display ,RD)

核糖体展示技术由Pluckthun等[16]在多聚核糖体展示技术的基础上改进而来，是一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选的新技术该技术完全在体外进行，其文库容量不受细胞转染效率的影响，库容量和筛选效率得到很大的提高而且它可与其他技术相组合，在体外分子定向进化方面具有独特的优势[17] 。

RD 基本步骤如下:抗体基因的克隆 ,PCR扩增抗体基因文库,同时加入启动子，核糖体结合位点及茎环(loop ) ,然后转录成 mRNA ; 在大肠杆菌或真核细胞核糖体系统中翻译 , 迅速置冷可终止翻译 。本过程中需加入Mg2 +来增强核糖体的稳定性以及核糖体上结合的抗体的折叠程度，利用抗原抗体反应的特异性 ,从翻译后的混合物中利用固相化抗原亲和筛选出兴趣核糖体复合物,同时非特异性部分可通过洗脱去除。核糖体复合物可通过EDTA 解聚或特异性抗原洗脱 ; mRNA 从核糖体复合物中的分离 ; mRNA 逆转录成 cDNA ,并通过 PCR 增 ,cDNA 用于下一轮循环的富集、筛选 ,部分用于克隆和序列分析[18] 。

糖体展示技术因其完全脱离细胞系, 简化了翻译及转录的过程, 具有高质量的转化效率, 完全克服了噬菌体展示技术等体内展示技术的缺点而逐渐成为现在较先进的融合蛋白筛选技术, 是一项比较敏感的筛选技术[19]。核糖体展示技术只需要通过 PCR 就可实现克隆的扩增和复制 ,这就很容易与体外突变技术 ,进行定向进化 。另外 ,在体外核糖体展