生化实验13个问题(考试)

1什么是生化研究技术？

生物化学研究技术是指用物理学、化学和生物学的现代技术来研究生命物质的化学组成、结构及生命过程中各种化学变化的科学。研究内容主要为生物体的化学组成新陈代谢与代谢调节控制生物大分子的结构与功能酶学研究生物膜和生物力能学激素与维生素生命起源方法学等。

2 生化研究技术中，常用的层析方法有哪些？

答：一、吸附层析1、吸附柱层析2、薄层层析3、聚酰胺薄膜层析

二、离子交换层析三、凝胶过滤四、亲和层析五、聚焦层析

3 常用的电泳方法有哪些?

答：一、纸电泳法

二、醋酸纤维素薄膜电泳法

三、琼脂糖凝胶电泳法

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法

五、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

4 测定蛋白质分子量的方法有哪些？

凝胶电泳、分子筛过滤、盐析沉淀、质心法、沉降法（超速离心法）

5 如何提纯一种蛋白质？

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

（四）样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

6 SDS-PAGE结果不满意或失败的原因有哪些？

一、SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。

二、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10％误差，不可完全信任。

三、有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS 的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。

四、有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。

五、如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

7 做酶的相关实验要考虑和注意的事项有那些？

盐析法分离纯化POD及活力测定:

一、硫酸铵盐析的注意事项：

（1）所用硫酸铵的纯度要高，这一点对酶尤为重要；

（1）分离几种酶时，可采用分段盐析法，盐的饱和度由低到高增加，加入硫酸铵时，要少量多次，尽量避免局部浓度过大，要让硫酸铵充分溶解。至少放置30min后才进行离心操作。

（1）要严格控制温度和pH

（1）蛋白质的浓度不能过高，一般在2.5%~3%为宜，太高易产生沉淀。

（1）盐析得到的酶一般需要脱盐，才能获得纯品或进行层析操作进一步纯化。

二、有机溶剂分级沉淀法的注意事项：

（1）有机溶剂沉淀是个放热过程，一般应在0度左右一度进行，溶剂应预冷，加入时要边搅边滴，以免局部浓度过高，使酶变形；

（1）溶剂的pH最好控制在被分离酶的等电点附近，以提高分离效果；

（1）酶的浓度应控制在5-20mg/ml范围内，过高易产生共沉淀，过低易变性，可加入甘氨酸等介电常数大的物质避免；

（1）有机溶剂在中性盐存在时可减少蛋白质变性，增加蛋白的溶解度，提高分离效果，但过高会使蛋白过度析出。一般盐浓度为0.005mol/L左右，离子浓度应控制在0.05-0.1范围内。

离子交换层析分离纯化SOD以及活力测定:

（1）植物中的酚类可使SOD失活，加入PVPP等可出去酚类。

（2）SOD测活时，NBT的光还原与光照强度和时间有关，应严格控制。

（3）侧活力加入的酶量，亦能抑制反应的50%为佳。

（4）选择合适的交换剂是离子交换层析分离大分子能否成功的关键之一。

（5）离子交换剂的预处理十分重要，尤其是使用过的离子交换机。

（6）加样时应注意