2主要科技创新内容

项目名称：微生物发酵产物高效制备共性关键技术

（一）立项背景：

微生物发酵是利用微生物作为细胞工厂、进行物质合成或生物催化与转化的过程。通过微生物发酵过程，可以实现氨基酸、蛋白质、酶制剂、核苷酸、有机酸、手性药物、香料、生物燃料等多种产品的高效生产，对于医药、化工、食品、能源等行业具有重要的作用。由于微生物发酵具有生产效率高、环境友好等优点，随着全社会对于生态文明的重视度越来越高、政府监管部门对环境保护的管理力度越来越强，微生物发酵的应用也越来越普遍，研究微生物发酵过程、破解制约微生物发酵水平的关键共性技术问题、创新微生物发酵研究方法和技术手段对国民经济发展和社会文明建设的重要性也越来越显著。一般而言，影响微生物发酵水平的关键共性技术问题包括：如何进行高产菌株的高效筛选，如何优化发酵条件，如何强化菌株的代谢能力，如何进行发酵产品的高效分离和纯化等。研究这些关键共性技术问题不仅是微生物发酵研究的核心问题，也是生物工程领域的重要问题，研究这些技术问题具有重要学术意义和应用价值。

（二）详细技术内容：

1、总体思路：

项目的总体思路是选择代表性的微生物发酵产物为研究模型，通过对具体发酵产品发酵过程中关键技术问题——高产菌株筛选、发酵条件优化，代谢过程强化、产物分离纯化——的研究，发明新的菌株筛选模型，探索统计优化方法在发酵条件研究和优化中的应用、创新高效的发酵条件优化策略和手段，开发新的菌株代谢性能强化技术、通过菌株代谢性能的强化提高发酵水平，创新高效的产物分离纯化方法，并从中总结可用于其他微生物发酵过程的新方法、新手段和新技术，推动微生物发酵技术的进步。

2、技术内容：

本研究选择了γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)和纳豆激酶作为具体的研究对象，按照总体思路，对它们的发酵全过程进行了全面和系统的研究。GABA是哺乳动物中枢神经系统的一种重要的抑制性神经递质，具有抑制中枢神经系统过度兴奋、解除神经紧张等生理功能。研究发现，GABA对人体具有

镇静安神、促进睡眠、健脑益智、降低血压、改善免疫功能、延缓衰老等作用，在日本、美国等国家已广泛用医药、食品和化妆品等行业。纳豆激酶是日本科学家须见洋行从纳豆中发现的一种具有纤溶能力的丝氨酸蛋白酶，能较为特异的溶解血栓中的纤维蛋白，具有溶栓活力高、安全好、可口服等优点，在血栓相关疾病治疗和预防等方面具有广泛的应用前景。本项目团队分别从2001年和2002年开始进行纳豆激酶和GABA的微生物发酵研究，对菌株筛选、发酵过程优化、产物分离纯化等关键技术环节进行了深入研究，通过创新菌株筛选模型、引入统计手段进行发酵过程优化研究、革新产物分离纯化工艺，攻克了高产菌株筛选、发酵条件优化、产物高效提取纯化等技术问题，取得了以下创新成果。

(1)发明了酪蛋白平板初筛-摇瓶复筛策略，从日本纳豆中筛选获得了一株高产纳

豆激酶枯草杆菌，产酶活为970 IU/ml，该方法已经成为了筛选纳豆激酶的经典方法，被后续研究广泛采用；

(2)采用Plackett-Burman方法对影响发酵的各因素进行评价，用最陡爬坡路径逼

近最大产酶条件区域，通过中心组合实验及响应面分析优化了发酵条件，发酵液酶活提高到1314 IU/ml，不仅显著提高了纳豆激酶的发酵水平，而且是国内最早综合应用Plackett-Burman方法和响应面分析优化发酵过程的研究之一，推动这种优化方法的普及，促进了国内发酵过程优化研究的发展；(3)对纳豆枯草杆菌的发酵方式进行了研究，制备了多种固定化培养材料，采用

海藻酸钠/纤维素硫酸钠-CaCl2/聚亚基二胍氯化氢微胶囊固定化培养，使纳豆激酶发酵活力达到2465 IU/ml，创造了纳豆激酶发酵产量的新记录；

(4)从未经巴氏消毒的生牛奶中分离筛选到一株产GABA的乳酸菌hjxj-01，经过

UV和60Co两种诱变剂处理，通过筛选抗产物GABA突变株，得到了一株高产GABA的菌株Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306，该菌株发酵72h后GABA 产量达到17g/L；

(5)用Plackett-Burman方法识别出了影响Lactobacillus brevis CGMCC 1306发酵制

备GABA的2个关键因素——溶氧和pH值，确定了基于溶氧和pH值控制的发酵优化策略，创新性地采用人工神经网络(ANN)与粒子群算法（PSO）算法相结合的方法对GABA 发酵过程进行了建模和全局寻优，得到最佳培养基组成和初始培养条件，使GABA的发酵产量达到33.42g/L。在此基础上，在3

升发酵罐中通过溶氧和pH 控制调控底物谷氨酸转化为GABA 和GABA 转化琥珀酸的代谢流量，使GABA 在分批补料发酵72小时的产量达到78 g/L ，发酵91.5小时后产量达到107.5 g/L （图1）；在500升发酵罐上进行了GABA 发酵中试研究，通过溶氧和pH 值，使发酵72h 时GABA 产量达到40.1 g/L （图2）。

B i o m a s s a n d

G l u c o s e (g /L )

Time(h)

L -M S G a n d G A B A (g /L )

图1 GABA 分批补料发酵过程中生物量、葡萄糖、谷氨酸和GABA 变化（3升发酵罐）

时间

/h L -M S G 浓度/(g ⋅L -1

)

G A B A 浓度/(g ⋅L -1

)

图2 500升发酵罐中GABA 的发酵进程曲线

(6) 对发酵液中GABA 的后提取方法和工艺进行了研究，设计了独创性的壳聚糖

絮凝→大孔树脂吸附脱色→离子交换层析→结晶精制的GABA 分离纯化工艺，实现了高纯度GABA （＞98％）（图3）的高效制备，不仅弥补了发酵液中GABA 分离纯化方法和工艺的研究缺失，而且为其他氨基酸类发酵产物的分离纯化研究提供了新的路径；

图3 结晶获得的GABA 晶体（纯度＞98％）

(7) 设计了独创性的GABA 发酵与与米根霉乳酸发酵相耦合制备 GABA 和乳酸的

新工艺，一方面利用乳酸发酵产生的H +进行发酵液的pH 值控制，另一方面领用 GABA 发酵对H+的消耗来解除乳酸发酵中的酸抑制，达到了2种发酵过程的互补和自动平衡，实现了GABA 和乳酸的高效、经济制备（Glu 到 GABA 的摩尔转化率达到 96.5%，乳酸的产量达到 80.2 g/L ）；