流式细胞仪在免疫学研究中的应用

流式细胞仪在免疫学研究中的应用

摘要：随着现代激光技术、电子检测技术和电子计算机技术等的迅速发展，流式细胞仪(FCM)在免疫学、生物学、遗传学、血液学、临床检验等领域中得到了更加广泛的应用。在免疫学研究领域，FCM以快速、灵活及定量等特点被广泛地应用于基础研究和临床治疗的各个方面，尤其是与单克隆抗体技术的结合，使其在免疫分型、分选、免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面发挥了重要的作用，成为现代免疫学研究不可缺少的工具。该文对近年来流式细胞仪在免疫学研究中的应用进展进行了综述。

关键词：流式细胞仪；免疫学；检测

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器[1]。FCM 可对细胞大小、细胞表面抗原的表达等进行快速、灵活、定量、多参数的检测，而且，可同时用于检测细胞内的核酸定量、DNA倍体、细胞周期分析，细胞因子和黏附分子等[2]。具有分析速度快、精确度高、重复性好和费用低廉等优点。

1 流式细胞仪介绍

1.1 流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪主要由流动室和液流系统，激光源和光学系统，光电管和检测系统，计算机分析系统和细胞分选系统5部分组成，其中，流动室是仪器的核心部件。

将待测标本制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，由气压装置送入流动室，以一定的流速经过喷嘴进入激光聚焦区，流速的选择与检测的目的有关，此时，在激光束的照射下，被荧光染色的细胞产生散射光和激发荧光，其散射光信号和荧光信号经光学系统收集，由检测系统转换成为电信号，再通过模/数转换器，转换为可被计算机识别的数字信号，各种信号经计算机采集后，用相应的应用软件进行分析处理，最后，以直方图或三维图的形式显示出来。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征参数，从而可以对细胞进行分类[3]。

1.2 流式细胞仪机型介绍

近年，流式细胞仪的主要生产厂家有美国的BD (BectonDickinson)公司、贝克曼库耳(B eckman Coulter)公司和德国的Partec公司。国内使用的流式细胞仪主要由前两家生产。它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪，并研制生产了流式细胞仪所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。

流式细胞仪可分为两大类，一类为临床分析型(又称小型机、台式机)，其特点为仪器光路调节系统固定，自动化程度高，易学易掌握，适合在临床实验室中应用。如BD公司的FACSCalibur，BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Partec公司的Pas，Cytomation公司的M OFLO，Aber公司的Microcyte，Ortho公司Cytoron等。

另一类为科研分选型(又称综合型)，特点为功能齐全，分析灵活，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于广泛的科学研究之用。如BD 公司的FACSVantage，Beckman Coulter公司的EPICS ALTRA，Partec公司的PasIII及Cyt omation公司的MOFLOMLS等。

随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的发展，流式细胞仪的制造工艺、功能、精确度等有了质的飞跃。流式细胞仪已开始向模块化发展，即它的光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照试验要求随意更换[4]。各流式细胞仪生产厂商继续推出新产品以满足用户的不同需要。如BD公司的FACSAria (高速细胞分选仪) 、分选增强型FACSVantage SETM (多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSR II(数字化分析型流式细胞仪)，FACSCanto(双激光六色分析流式细胞仪)。BeckmanCoulter公司近年又推出了Cytomi cs ™FC 500系列，如FC 500MCL/MPL 采用单激光或双激光激发方式，可进行五色分析。Pa rtec公司的顶级科研型十三色荧光流式细胞仪CYFLOW ML，临床科研型六色荧光流式细胞仪DYFLOW SL。Amnis公司的Image Stream100(激光流动成像细胞仪)，将流式多色检测技术和荧光显微图像显示技术结合在一个平台上，不仅可以通过荧光信号的强度，还可以通过细胞荧光图像对细胞内外信号定位，从而对细胞亚群进行定性和定量分析。

2 流式细胞仪在免疫学中的应用

近年来，随着生物医学等相关学科的发展和免疫学研究的深入，流式细胞仪在分子免疫学、免疫生物学和免疫遗传学，免疫血液学、免疫药理学、移植免疫学、肿瘤免疫学、抗感染免疫学、临床免疫学等免疫学领域的基础学科，以及淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、细胞因子检测等临床研究中，也有了越来越广泛的应用。

2.1 淋巴细胞及其亚群分析

FCM在临床淋巴细胞及其亚群分析中得到广泛应用，可同时检测出一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开，并计算出它们相互间的比例。通过淋巴细胞及其亚群数量的检测，可了解在不同情况下机体的免疫功能状态，辅助临床疾病的诊断，探索疾病的发病机理、病程、预后，指导临床治疗方案[5]。

由于FCM可以进行高灵敏度、高速度和多参数分析，使FCM对血液淋巴细胞亚群的检测较其他方法更精确，故其被认为是血液淋巴细胞亚群分析的标准方法[6]。

2.1.1 检测项目在临床上，淋巴细胞及其亚群分析项目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4：CD8；绝对计数(TruCount)；活化淋巴细胞的检测(CD69/HLADR/CD71/B27)；CD4＋ Th/i和C D8＋Ts/c的进一步区分；Naive/Memory T细胞亚群的检测；Th1/Th2亚群的检测。

用流式细胞仪诊断某种疾病时，经常需要检测多个项目，如当人类感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要选择地侵入人类具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群中的辅助性T细胞，即Th细胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T细胞群被破坏，继而累及全身免疫器官，使机体免疫功能下降。检测的免疫指标表现为：T淋巴细胞总数减少(正常值的65%～81%)；T细胞亚群比值倒置，即Th/Ts<1.0(正常1.3∶12～2.1∶1)；Th细胞(CD4＋)绝对计数<200个/μL(正常值400～1 500细胞/μL)，CD8＋ T细胞在感染早期增多，后期则下降；Ts细胞增高，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则在正常范围；CD4＋/CD8＋明显低于健康成人(P<0.01)。

2.1.2 检测技术的发展随着新的荧光色素分子的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发技术的进展，多色荧光分析得到迅速发展，三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。近年，淋巴细胞及其亚群的分