流式细胞仪简介和使用方法
流式细胞术基础知识
讲者：***
目录
1、流式细胞术基本定义 2、流式细胞仪介绍 3、荧光染料介绍 4、不同型号流式细胞仪简介 5、流式细胞仪应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、 准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多 项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选
淋巴细胞亚群分析可以了解机体在不同条件下的免疫功能 状态，主要包括细胞免疫功能和体液免疫功能。在临床上，主要用 于对免疫系统造成明显干扰的相关疾病的辅助诊断，分析疾病的发 病机理，监控疾病的病程进展，观测疗效及监测预后等等。
流式细胞仪临床应用
临床意义 CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD8+ CD4+ / CD8+ B细胞 NK细胞
FITC, PE,ECD,PC5 or PECy5.5,PE-Cy7
APC, APC-Cy7
国食药监械(进)字 2014第2403463号
FITC, PE,ECD,PC5 or PC5.5,PC7
红光:638nm 紫光：405nm
APC，APC-Cy5 or APCAlexa Fluor 700, APC-Cy7 or APCAlexa Fluor
谢谢！
部分演示内容来源于网络，如有侵权，请联系删除！谢谢！
APC, APC-Cy7
浙械注准 20192220121
流式细胞仪应用
临床研究
血液，肿瘤， 药理，免疫…
环境研究
湖泊，海洋 生态研究…
生物学研究
遗传，生殖， 微生物，细胞 生物，毒理， 分子生物…
食品制药工业
食品检测、药物筛 选，疫苗研究…
《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
流式细胞仪原理结构及应用
维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。
3．三参数数据显示和分析
细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成
一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成 6 对数据）用一维直方图、二维点阵 图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可 直接给出 8 个数据 （如用 ABC 代表 3 种荧光， 可有 A+B+C+、 A+B+C- 、 A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-） 。 主要构造和工作原理： 主要构造和工作原理：细胞分选系统 如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞 流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴 上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预 定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不 含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而 实现了分选。分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献。 流式细胞术注(流式细胞仪)的应用 各学科研究中的应用 ①细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如 DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析， 并可纯化 X 或 Y 染色体。 ②肿瘤学：DNA 倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用 DNA 倍 体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用 单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 ③免疫学：研究细胞周期或 DNA 倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活 性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官 移植后的免疫学监测等。 ④血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析， 如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用 NBT 及 DNA 双染色法可研究白血病细胞分化成熟与 细胞增殖周期变化的关系， 检测母体血液中 Rh(+)或抗 D 抗原阳性细胞， 以了解胎儿是否可 能因 Rh 血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病， 如红斑狼疮等。 ⑤药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗 药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测 DNA 凋亡峰，Bcl-2 凋亡调节蛋白等。 细胞凋亡研究 细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细 胞凋亡有重要意义。 细胞凋亡检测方法很多， 应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中 发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。 1. 细胞形态变化：通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。在细胞凋亡早
流式细胞仪
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
目录* 1 原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3 应用* 4 参见原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。
若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。
当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。
这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。
前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。
可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等）流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
流式细胞仪使用简介
仪器名称：流式细胞仪生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司使用方法：一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。
流式细胞仪分类
流式细胞仪分类1. 简介流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的生物学实验仪器，用于对细胞进行分类和分析。
它通过将细胞悬浮液注入仪器中，利用激光束照射细胞，测量细胞在不同参数上的散射和荧光信号，从而对细胞进行分类和计数。
流式细胞仪广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
2. 流式细胞仪的分类方式根据不同的参数和功能，流式细胞仪可以分为以下几种类型：2.1. 基础型流式细胞仪基础型流式细胞仪是最常见的类型，它可以测量细胞在不同波长的激光照射下的散射和荧光信号。
基础型流式细胞仪通常具有多个激光器和多个探测器，可以同时测量多个参数。
常见的参数包括细胞大小、形态、颜色、荧光标记物等。
2.2. 高通量流式细胞仪高通量流式细胞仪是一种能够快速处理大量样本的流式细胞仪。
它通常具有多个样本载体和多个样本接口，可以同时处理多个样本，提高实验效率。
高通量流式细胞仪广泛应用于大规模细胞筛选、细胞库构建和高通量药物筛选等领域。
2.3. 分选型流式细胞仪分选型流式细胞仪是一种能够根据细胞的特定特征进行分选的流式细胞仪。
它通常具有一个或多个分选器，可以根据预设的分选条件将特定类型的细胞分选出来。
分选型流式细胞仪广泛应用于细胞克隆、单细胞测序和细胞治疗等领域。
2.4. 成像型流式细胞仪成像型流式细胞仪是一种能够对细胞进行高分辨率成像的流式细胞仪。
它通常具有高倍率物镜和高灵敏度的相机，可以对细胞进行三维成像和时间序列成像。
成像型流式细胞仪广泛应用于细胞动力学研究、细胞迁移和细胞内信号传导等领域。
3. 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理包括激光照射、散射信号检测和荧光信号检测三个步骤。
3.1. 激光照射流式细胞仪通过激光器产生高能量的激光束，将激光束聚焦到细胞悬浮液中的单个细胞上。
激光束的波长和功率可以根据需要进行选择，常用的波长包括488nm、532nm和633nm等。
3.2. 散射信号检测当激光束照射到细胞上时，细胞会发生散射现象。
细胞生物学技术：7流式细胞术---原理、操作及应用
（三）散射光的作用
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的 细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
BD公司分析型流式细胞仪
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
简介流式细胞仪
一、简介流式细胞仪（一）流式细胞仪概念流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。
简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。
（二）原理待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。
当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。
经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应的各种特性。
（三）流式细胞仪检测的细胞特性细胞结构组成 细胞功能大小 细胞表面、胞浆、核特异性抗原粒度 细胞活性DNA、RNA含量 胞内细胞因子蛋白质含量 激素结合位点钙离子、pH值、膜电位 酶活性二、流式细胞仪的临床检验项目目前在国内最常见的临床应用有两大类：一为肿瘤细胞的DNA含量析； 另一为细胞表面的表型测定，包括淋巴细胞亚型分析、免疫功能监测、白血病和淋巴瘤免疫分型、残余白血病检测、以及HLA-B27组织抗原检测等等。
1、淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率的变化监控疾病状态下的免疫状况（如肿瘤、感染性疾病、免疫性疾病等），以此辅助诊断、追踪病情发展及决定用药时机。
检测原理：利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪是一种用于细胞分析和分类的仪器。
它通过将细胞单个地以高速通过一个光束，并测量其多个特性，从而对细胞进行识别、计数和分析。
其基本工作原理如下：首先，细胞样品被制备成单细胞悬浮液，并通过细胞特异性的染色物质或标记物进行标记，以将目标细胞与其他细胞区分开来。
然后，样品被注入到流式细胞仪中，通过注射器控制样品的流速和流量。
在流式细胞仪内部，样品被推进到一个称为流动细胞室的地方。
在流动细胞室中，样品通过一个狭窄的玻璃管道，产生一个细细的流动。
该管道上方有一个光源，通常是一束激光。
这束激光被聚焦成一束光束，对通过的细胞进行照射。
当细胞通过激光束时，它们与激光发生相互作用。
细胞中的标记物会吸收激光的能量，并重新发射出来。
这些重新发射的光信号被称为荧光信号。
荧光信号与细胞的特征和标记物有关。
流出流动细胞室的细胞荧光信号被收集并分析。
收集荧光信号的方法是通过使用一组光学器件，如透镜和滤光器，将荧光信号定向到光电倍增管中进行光电转换。
光电倍增管会将光信号转化为电信号，并放大。
最后，通过分析仪器中的电子元件收集的荧光信号和流速的数据，可以得出关于细胞数量、大小和标记物强度等的信息。
这
些信息可被用于鉴定和分类细胞，分析细胞的功能和活性，以及研究细胞的生理和病理状态。
流式细胞术(贝克曼)
通过将流式细胞术与基因组学、蛋白质组学等技术相结合， 未来有望实现个体化医疗的精准诊断和治疗。这将为患者提 供更加定制化的治疗方案，提高治疗效果和生存率。
THANKS
感谢观看
血液学研究
造血干细胞研究
利用流式细胞术研究造血干细胞的自我更新、分化等 过程，有助于血液疾病的诊断和治疗。
白血病分型与诊断
通过流式细胞术对白血病细胞进行分型和鉴别，有助 于白血病的诊断和治疗。
红细胞与血小板检测
利用流式细胞术检测红细胞和血小板的数量和质量， 有助于贫血和出血性疾病的诊断和治疗。
04
流式细胞术的优缺点
优点
快速
灵敏度高
流式细胞术可以在短时间内处理大量样本 ，提高了检测效率。
流式细胞术能够检测到低浓度的细胞，灵 敏度较高。
多参数分析
自动化程度高
流式细胞术可以对细胞进行多参数分析， 包括细胞表面抗原、细胞内蛋白质和DNA 等。
流式细胞术通常采用自动化仪器进行操作 ，减少了人为误差和操作时间。
发展历程
20世纪50年代
流式细胞术的原理被提出，并开始应用于细 胞计数和大小测量。
20世纪80年代
计算机技术的引入，实现了自动化数据分析。
20世纪70年代
荧光染料和荧光显微镜的引入，使得多参数 检测成为可能。
21世纪
高通量测序技术的发展，推动了流式细胞术 在基因组学和蛋白质组学领域的应用。
应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表 面标志物、细胞因子 等，研究免疫细胞的 分化、发育和功能。
血液学研究
用于检测血液细胞， 诊断血液疾病，如白 血病、淋巴瘤等。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的 表面标志物、基因突 变等，为肿瘤的诊断 和治疗提供依据。
唯公流式细胞仪说明书
唯公流式细胞仪说明书唯公流式细胞仪说明书一、产品简介该流式细胞仪是一款高端技术的生物荧光图像分析仪器，具有快速、灵敏、高精度等特点，广泛应用于生命科学、医学研究等领域。
二、主要特点1.高灵敏度：可检测到极微小光信号，实现高度灵敏的光学检测；2.高分辨率：采用高精度镜头和滤光片，可实现高分辨率成像；3.宽波谱透射：可使用多种荧光和吸收光标记物，涵盖更广泛的应用场景；4.多通道检测：可同时检测多种标记物，提高检测效率；5.易于使用：人性化的操作界面，易于针对不同样本类型进行调整；6.数据分析功能：自动化数据处理功能，轻松完成荧光图像的分析；7.高效节能：节能设计，不仅保证高效工作，还能有效降低能源消耗。
三、主要参数1.激光器：488 nm，633 nm2.光源：氩离子激光器，He-Ne激光器3.探测器：八通道光散射及荧光检测4.检测灵敏度：2个荧光分子5.最大流速：1L/min6.样品速度范围：1个细胞/秒~10万个细胞/秒四、使用说明1.将样品加入样品管中，放入样品池，并调整流速；2.选择合适的荧光标记物；3.启动流式细胞仪，进行数据采集；4.导出数据文档，进行数据分析。
以上仅为简要使用说明，详细操作步骤请参考唯公流式细胞仪用户手册。
五、注意事项1.严格按照操作说明使用，避免误操作；2.样品池应进行定期清洗和消毒；3.在操作时应佩戴手套和口罩，避免样品的污染；4.不得私自拆卸设备，有需要时请联系唯公流式细胞仪售后服务。
请您务必仔细阅读唯公流式细胞仪使用说明，并按照操作步骤进行操作，以充分发挥设备的检测效果。
流式抗体使用说明书
流式抗体使用说明书引言在生物医药领域，流式抗体是一种重要的研究工具和临床诊断方法。
本使用说明书旨在提供关于流式抗体的详细信息，包括流式抗体的定义、原理、操作步骤、注意事项和实验结果分析等内容。
通过本使用说明书，用户可以全面了解并正确使用流式抗体。
一、流式抗体简介流式细胞仪是一种利用流式抗体技术进行细胞分析和检测的仪器。
流式抗体是一种特制的抗体，通常与荧光染料结合，用于特定细胞表面分子的检测和定量。
1.1 流式抗体的定义流式抗体是一种能够特异性识别并与目标细胞分子结合的抗体，通过与荧光染料结合，实现对目标细胞分子的快速检测和定量。
1.2 流式抗体的原理流式抗体的原理是通过将荧光标记的抗体与目标细胞表面的特定分子结合，通过流式细胞仪的激光扫描和荧光检测系统，对细胞进行定量分析。
二、流式抗体的使用步骤正确的使用流式抗体，包括样本处理、孵育、洗涤和荧光检测等多个步骤。
2.1 样本处理1.将待检样本收集于离心管中；2.使用适当的方法对样本进行预处理，如细胞裂解、细胞固定等。
2.2 孵育1.将流式抗体加入样本中，与目标细胞分子发生特异性结合；2.对样本进行适当孵育，使抗体与细胞充分反应。
2.3 洗涤1.使用含有缓冲液的离心管对样本进行洗涤，去除未结合的抗体；2.重复洗涤步骤，以确保洗涤彻底。
2.4 荧光检测1.使用流式细胞仪进行荧光检测；2.调节仪器参数，包括激光强度、放大倍数等；3.记录荧光强度，进行数据分析。
三、流式抗体的注意事项在使用流式抗体时，需要注意一些事项，以确保实验结果的准确性。
3.1 样本的选择和处理1.样本的选择应根据实验设计和研究目的确定；2.样本的处理要遵循操作规范，避免细胞损伤或污染。
3.2 抗体的选择和稀释1.抗体的选择应根据目标细胞分子确定；2.抗体的稀释应在小规模试验中进行优化。
3.3 仪器操作和参数调节1.使用流式细胞仪前，需要对仪器进行校准和质量控制；2.在操作过程中，根据实际需要进行参数调节，以获得准确的荧光信号。
流式细胞仪简介
流式细胞仪简介▲流式细胞仪主要由五部分组成1.流动室和液流系统；2.激光源和光学系统；3.光电管和检测系统；4.计算机和分析系统；5.细胞分选系统1.流动室的基本结构流动室是仪器的核心部件，被测样品在此与激光相交，得到准确的细胞荧光信息。
2.激光源和光学系统通常以激光作为发光源（氩离子气体激光器和小功率半导体激光器）。
被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
3.光电管和检测系统：通过光电转换器转变成电信号而进行测量。
▲二种探测器和二类放大器▲二种探测器:光电二极管和光电倍增管。
光电二极管对光的敏感度低于光电倍增管,用于探测FSC, 因FSC是强信号。
光电倍增管（PMTs）用于探测SSC,FL1,FL2,FL3,因为它们是弱信号。
两类放大器:线性放大器：输出信号辐度与输入信号成线性关系。
对数放大器：输出信号和输入信号之间成常用对数关系。
放大器的作用:可对信号进行微调。
对FSC,SSC,FL1,FL2,FL3可设置放大模式和放大增益。
4.计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。
荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
▲流式细胞仪系统流程：标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统→结果打印▲流式细胞仪有关的测量参数及数据处理▲测量参数：检测数据的显示视测量参数的不同有多种形式可供选择。
第一激光（488nm）激发出的FL1,FL2,FL3,第二激光（635nm）激发出的FL4。
▲数据处理：主要包括数据的显示和分析。
流式数据一般用一维直方图、二维散点图来表示。
▲激发光光源波长488nm的示意图▲测量参数：1.散射光信号：前向角散射和侧向角散射（细胞的物理[固有]参数）(1)前向角散射，即FSC与细胞的大小（直径的平方）相关，我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。
流式细胞仪(Flow Cytometer)原理及应用-12.4
7 recip 9-22 9-12
Chromomycin A3
（GC）
结束语
流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很 强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑 战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，在科 研领域灵活运用这项技术，报告最科学、最真实 的客观数据，是我们的目标。
单参数直方图（Histogram）
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
便于数据统计 不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记 主要表达方式
二维点图Dot Plot
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC PE PETR
PE-CY5
侧向散射光(linear) 侧向散射光
前向散射光 (linear)
CD14 PE (log) CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45<单核细胞)
细胞分选
流式细胞仪的测量对象
大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围： 大小范围：0.2uM-300uM。 。 对象类型 细胞类型： 细胞类型： 高等真核细胞； （1） 高等真核细胞； 酵母； （2）酵母； 细菌； （3）细菌； 多细胞的聚集体，如胰岛等。 （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 非生命颗粒： 和其它细胞器以及乳化微球等。 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 标记 单细胞 悬液 检测 荧光抗体
流式细胞仪行标
流式细胞仪行标
流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）是一种用于分析和分离活细胞的实验室技术。
它可以用来测定细胞的大小、复杂性（颗粒度）、内部荧光强度以及细胞表面或内部的特定分子标记。
流式细胞仪的工作流程大致包括以下步骤：
1. 样本制备：首先需要将细胞样本制备成单细胞悬液，并加入荧光染料或抗体以标记目标分子。
2. 染色：细胞悬液与荧光标记的抗体或染料混合后，孵育一段时间以使标记物结合到目标细胞上。
3. 样本加载：经过染色的细胞样本通过流式细胞仪的样本输入系统，通常是一个细管，称为流道。
4. 液流形成：细胞样本被雾化成单个细胞的液滴，这些液滴通过流道以一定速度流动。
5. 激光照射：流动中的细胞逐个经过激光束的照射。
激光激发细胞内或表面的荧光标记，使其发出光信号。
6. 信号检测：流式细胞仪配备有光电探测器，用来检测细胞发出的光信号。
每个细胞产生的信号被转换为电信号，并记录下来。
7. 数据分析：收集到的信号被计算机系统分析，根据细胞的荧光强度和散射光特性，可以得到细胞的各种参
数，如细胞大小、颗粒度、细胞膜和胞内分子的表达水平等。
8. 数据呈现：分析结果通常以二维图表（如前向散射与侧向散射图、荧光强度直方图）或三维/四维图表的形式展现，便于研究者进行进一步的数据解读和实验设计。
流式细胞仪广泛应用于免疫学、肿瘤学、细胞生物学等领域，对于疾病诊断、细胞分选、功能性研究等方面有着重要作用。
通过精确地测量和分析细胞的物理和化学特性，流式细胞仪能够提供关于细胞状态和功能的丰富信息。
bd流式细胞仪
• 用于血液病治疗监测，
血液病预后评估
如化疗疗效、复发监测等
• 有助于血液病的治疗效
果评估和及时调整治疗方
案
• 用于血液病预后分析，
如白血病、淋巴瘤等
• 有助于血液病的个体化
治疗和风险评估
Bd流式细胞仪在免疫性疾病诊断中的应用
免疫性疾病监测
• 用于免疫性疾病治疗监测，如免疫抑制剂疗效、复发监测等
• 有助于疫苗的研发和应用
• 用于微生物检测、有害物质检测等实验
02
Bd流式细胞仪的工作原理
及技术特点
Bd流式细胞仪的工作原理
工作原理
细胞分析
• 细胞悬浮液在鞘液的包裹下形成细胞流
• 通过光散射分析细胞的大小和形态
• 激光束照射细胞，产生散射光和荧光信号
• 通过荧光染色分析细胞的类型和功能
• 检测器接收信号，进行放大和模数转换
定期清洁仪器
• 清除仪器表面的灰尘和杂质
• 保持仪器的清洁和稳定
⌛️Biblioteka 及时更换消耗品• 如激光器、检测器等
• 保证仪器的正常运行
04
Bd流式细胞仪在生物医学
中的应用
Bd流式细胞仪在细胞研究中的应用
细胞计数
• 用于细胞群体分析，如细胞增殖、凋亡等
• 有助于研究细胞的生命周期和生物学特性
细胞分选
• 用于细胞分离，如干细胞、免疫细胞等
肿瘤诊断和治疗
• 用于肿瘤诊断，如肿瘤细胞表面抗原检测等
• 有助于肿瘤的早期诊断和个体化治疗
05
Bd流式细胞仪在新药研发
及疫苗评价中的应用
Bd流式细胞仪在新药研发中的应用
01
流式细胞仪原理及应用
数据存储
• FCS 2.0格式
• 常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参 量依次排列顺序存储
FSC SSC FL1 FL2 Event 1 30 60 638 840 Event 2 100 160 245 85 Event 3 300 650 160 720
• 诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血症）或继发 性免疫缺陷病（如AIDS）
• 造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）
• Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风
湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）
• Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性
淋巴细胞 活化功能研究
T淋巴细胞活化
BD Biosciences Immune Function
• 细胞数目增殖 • 细胞表面表达
活化标记 • 分泌细胞因子
CFSE示踪原理
• 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种 可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以 不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。 当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个 子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。 这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧 光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光 和荧光检测通道可对其进行分析。
数据分析
等高图和密度图分析
BD Biosciences Immune Function
数据分析
三维图分析
BD Biosciences Immune Function
BD Biosciences Immune Function
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技巧二：阴性对照
• 阴性对照作用：调节PMT电压；设立阴、阳性界线
• 使用抗体相应同型荧光免疫球蛋白作为阴性对照，注对照及抗体 需出自同一厂家（检测一过性样本中的某些指标） • 使用对照组样本作阴性对照（与其他实验中对照组含意相同，但 此时仍需使阴性对照初始化仪器）
操 作
1. 准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量）， 等量PBS稀释； 2. 准备1ml Histopaque 1077 (Sigma)； 3. 室温下700g离心30分钟； 4. 仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；
5. 加4ml BSA-PBS，400g离心10分钟；
6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。
• 对与非抗体染色，如各类核酸染料或探针：PI、ANNEXIN-V。使 用空白标本作为阴性对照，或设立阳性对照。
技巧三：常见故障及解决
• 时刻注意鞘液及废液桶液量，熟悉仪器各类报警信号
• 通过软件操作仪器，很少能引起仪器硬件固障
• 如样本中有可见颗粒，建议过滤后再检测
• 如仪器经常不使用，管道会结晶、长菌、堵塞、漏气，此时叫工 程师便可解决 • 如仪器出现硬件故障，通常是仪器自身问题，与操作者无关
从组织获取淋巴细胞
淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松
散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤 便可。
方 法：
1. 将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS； 2. 将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离； 3. 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。
3 µg s/n = 2.5 1 µg s/n = 2.1 0.3 µg s/n = 2.4
0.1 µg s/n = 4.1
0.03 µg s/n = 4.8
0.01 µg s/n = 4.6
3
0.003 µg s/n = 3.5
0.001 µg s/n = 3.2
auto
60
Signal to Noise
细胞计数方法
• 传统手工计数：耗时、准确度差 • 流式细胞仪计数： BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？
partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度
反应体积
• 样本中加完抗体后， 1×106细胞反应体积应不小于100ul。
抗体染色
• 最为普通的抗体染色原则：
7. 5ml的吸样管
8. 35um尼龙滤网 9. DNase
操
作
1. 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切
成1mm3大小，用镊子将其分离； 2. HBSS或PBS洗清 3. 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS；
4. 37º C摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；
其他类型细胞
在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不 同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消 化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、 鼠上皮细胞。
材
1. 解剖刀
料
2. 0.15%胰蛋白酶
3. Hanks’s缓冲盐或PBS，pH7.3 4. 不含Ca、Mg离子的HBSS 5. II型胶原酶 6. 1%BSA或5%FBS
注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸
为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于NH4CL的BD 公司的FACSLyse溶血剂。
优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地
将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。
缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，
随时间细胞形态变化大。
方法二：密度离心法提取单个核细胞
Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠)
混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒 细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆
层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。
流式细胞仪标本处理一般原则及方法 流式细胞仪使用一般方法及技巧
李爱军 渭南市中心医院检验科
第一部分
流式细胞仪标本准备
染色的一般原则及方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。 根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。
可用的抗凝剂如下：
EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml
其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进
行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。
制备大鼠肾脏浸润细胞
材料： 解剖刀、CO2孵育箱、滤网
以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）
方
法：
1. 将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块； 2. 加入10ml胶原酶溶液，37º C CO2培养箱孵育30分钟； 3. 滤网过滤； 4. 密度梯度法离心提纯淋巴细胞。
• 价格较FITC昂贵
PE-Cy5 TC
• 激发光488nm, 发射光667nm 为复合荧光素，荧 光激发较率较高， 信号强
FTIC、PE、PE-Cy5三 者为流式细胞最为常的 荧光，并经常将三者共 同使用进行三色分析
PE-Cy7
• 激发光488nm， 发射光767nm • 为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳 • 与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光 谱之间影响较小
细胞培养
许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细 胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。
准备单细胞悬液
1.仪器和试剂： 0.25%r EDTA,pH 7.2
0.25% 的胰酶
10%血清的培养液 2.方法：
a. PBS洗涤细胞；
b. 加入0.25%有胰酶，37º C处理2~8分钟； c. 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。
3. 分装后-20º C保存
二、0.1% BSA-PBS缓冲液
1. 准备500ml，PH7.3 PBS 2. 加入5ml 10% BSA 3. 使用0.45um滤网过滤
三、氯化铵溶血剂
1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.2 3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤
技巧四：检测指标
• 检测前要清楚地知道：除阳性百分比指标外，还有荧光强度指标。 后者往往比前者更有意义
• 检测时，灵活应用放大模式：线性或对数（如指标相差不大，使 用线性放大，如：SS、FS；一般荧光参数使用对数放大） • 灵活运用门的逻辑关系及颜色示踪功能，可使检测结果更为明了
50
TITER
40
30 20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
Dilution
孵育、溶血、固定
• 抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞
内因子检测需冰育） • 溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页） • 样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间
白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：
富集白细胞
方法一：溶血法
1. 取100 ul抗凝全血； 2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀； 3. 室温孵育10分钟；
4. 4º C，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；
5. 4º C，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；
6. 4º C，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。
细胞膜电位、离子、脂类探针
• 现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、 pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻 易检测各种细胞功能，可实现一些异想不到的效果。 • 详细信息，见细胞探针公司网站：
与流式细胞仪相关的荧光术语
• MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome） 等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光 强度 • 自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长 的荧光。白细胞自发荧光强度为650~1150MESF，血小 板及其他颗粒自发荧光更低 • 流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在1000MESF以 内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：300MESF 以内
第二部分
流式细胞仪使用一般方法及技巧
上机检测
• 样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测 • 打开流式细胞仪：预热及进行质控程序 • 选择相应的方案或新建方案
• 加载或重新调节各参数
• 上样检测
技巧一：定位目标细胞群体
• 寻找细胞群：如标本为外周血，在FS/SS散点图中信号 最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。 要寻找淋巴细胞，可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后 逐步调高电压依次寻找各细胞群。
APC
• 激发光633nm， 发射光660 在配有双激光的流 式细胞仪上，此荧 光染料与FITC、PE、 PE-Cy5联用做四色 分析。但现在因单 激光四色可实现， 故使用该染料意义 不大。
核酸染料
染料 Propidium Iodide Ethidium biromide 7-Aminoactinomycin D Acridine Orange Chromomycin A3 Hoechst 33342 DAPI Pyronin Y Thiazole Orange YO-PRO-1 TO-PRO-3 LDS 751 激发光 发射光 495342 639 493320 637 546 647 503 530(DNA) 640(RNA) 430 580 395 450 372 456 545 565 509 533 642 661 642 661 543 712 光源 488 488 514488 488 457 UV UV 514488 488 488 630 488