分子遗传标记及其应用

分子遗传标记及其应用

摘要：分子遗传标记育种是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用。本文介绍了分子遗传标记的概念及应用。

关键字：分子遗传标记，标记辅组选择

Abstract：Served as an newly rising genetic marker technique,molecule genetic markers is being widely used on molecule biology,especially in molecule genetic researches. This article gives a brief introduction of the conception and utilization of molecule genetic markers.

Keywords:marker assisted selection；molecule genetic markers

一．分子遗传标记技术

1．1分子遗传标记的定义

DNA分子遗传标记技术是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用，由于真核生物的遗传信息都储存在染色体和细胞器基因组的DNA序列中，因此从理论上讲，DNA水平上的分子标记是所有遗传标记中最为稳定，最为可靠的。随着现代分子生物学技术的发展，使直接利用DNA序列中核甘酸的变异作为遗传标记成为了可能。

目前，对分子遗传标记较完整的描述，是指易于识别，遵循孟德尔遗传模式的，具有个体特异性或其分布规律具有种质特征的某一类表型特征或遗传物质；其范围包括：

①基因或遗传物质的产物的变异特征；

②作为基因或遗传物质载体的染色体的形态学变异；

③基因或遗传物质本身的变异[1]。

1．2分子遗传标记的作用

分子遗传标记能够在DNA水平上对编码和非编码序列的遗传变异进行检测，不受内外环境的影响；大多数分子标记多态性的信息含量很高；而且检测迅速、方便，无组织差异。由此可见，分子遗传标记是最理想的遗传标记，这决定了它能够得到迅速的发展，并能够广泛的应用于遗传育种研究和农牧生产的各个领域。

遗传标记主要有如下应用

（1）定位基因序列在染色体上的位置。

（2）构建遗传连锁图谱。

（3）定位数量性状基因座。

（4）对与性状相关的候选基因和主基因进行鉴定。

（5）对动物种群遗传资源进行评估。

（6）进行系谱/血缘分析。

（7）分类学与分子系统学研究，进行系统发育分析和绘制生物进化树，研究基因结构和功能进化。

（8）胚胎的早期性别和性状诊断，为选择性坠胎术提供参照依据。

（9）动物基因身份证。

（10）遗传性疾病或遗传缺陷的诊断与分析。

（11）已知病原微生物的株型（毒力）、抗性分型。

（12）对混合感染和继发感染疾病进行诊断与分析。

（13）在分子遗传流行病学中的病源鉴定，毒力进化跟踪，传播途径、速度、媒介分析和流行规律分析。

（14）微生物群落的生态位检测。

（15）出入境病原、种质监测。

（16）转基因动植物上的应用。

（17）进行药物基因学（Pharmacogenomics）研究。

（18）分子育种（molecular breeding ）应用

（19）器官移植中的应用。

1．3分子遗传标记的发展趋势

当前分子遗传标记的发展，有以下五个趋势：

（1）对现有遗传标记技术进行优化与集成，降低检测成本，提高检测效率，组合已有标记技术，同时提高标记的靶向性，使反映的信息专一性更加突出。

（2）充分利用基因组结构的共性特征开发新标记，如重复序列、散在保守序列，新基因家族，启动子保守序列等，利用基因和基因内部模块“界标”保守序列，挖掘并利用基因组中编码元件与非编码序列的保守特征，从而发现更多更稳定、效应更显著的分子标记。

（3）开发揭示新遗传变异类型的标记，如表观遗传差异，表达丰度差异，表达模式差异等。

（4）标记开发向高通量方向发展，如SNP芯片，变性高效液相色谱DHPLC，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF)等。

（5）同时揭示多层次信息的复合标记，从基因组→转录组→蛋白组→代谢组→表型组，各层次信息的不平衡性决定了仅用单层次标记的局限性，使用多层次的标记，更能展示基因的表达调控方法和作用。

1．4分子遗传标记的主要方法

随着分子生物学技术的发展，在DNA分子遗传标记中，出现了越来越多的新方法，现选择主要方法，介绍如下：

1．4．1 DNA限制性片段多态(RFLP)技术

RFLP技术是1980年美国学者Botstein首次发现的第1代分子标记技术[2]，当核苷酸序列出现碱基替换、插入、缺失及倒位等分子重排时，可能会导致限制性酶切位点的丢失和获得[3]，RFLP的优点主要表现在：

①RFLP标记无表型效应，非常稳定，故其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；

②RFLP标记在等位基因间是共显性的，因此能区别纯合子和杂合子，非等位基因间则不存在上位效应，互不干扰；

③RFLP是起源于基因组DNA的自然变异，这些变异在数量上几乎不受限制，可以选取足够数量的代表整个基因组的RFLP标记。因此，作为第一代分子标记，至今仍是使用最为广泛分子遗传标记技术。

1．4．2 DNA 扩增片段单链构象多态(PCR - SSCP)

1989年，日本Orita M等[4]发现单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象。这种立体结构主要由其内部碱基配对等分子内相互作用来维持。故当有碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使其分子构象发生改变。因空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中前进时受到的阻力不同，会导致电泳的速度不同，经染色后就可以在凝胶上面检测出结果，因此该方法被称为单链构象多态性( single strand comformation polymorphism，SSCP)分析。

PCR-SSCP技术是把PCR技术和SSCP技术相结合，将PCR 扩增产物变性后，置于碱性非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，从而检测相应的遗传变异。

PCR-SSCP分析法的优点在于：操作简单，不需特别贵重的仪器，PCR 产物变性后无需特殊处理即可直接电泳；实验步骤少，周期短；所用试剂常见，成本较低；适合于进行大样本筛查，在做DNA测序之前采用此法，可以大大避免盲目测序所带来的麻烦，加快测序速度，PCR-SSCP既能分析DNA的多态性，结合软件分析后，还可以检测DNA序列中的各种突变，还可以应用到基因制图等领域。

1．4．3 随机扩增多态性DNA

随机扩增多态性DNA（RAPD）技术最早是1990年，由美国杜邦公司农产品研究中心的Williams等[5]用任意顺序排列的10个碱基的寡核苷酸片断作引物，以未知序列的基因组DNA 作为模板，通过PCR扩增来获得一组随机的不连续的DNA片段。并将此法命名为RAPD。

目前RAPD技术已被广泛应用于遗传学的各个方面。包括进行品种鉴定和系谱分析，基因定位，易位系的鉴定和构建遗传图谱等。

1．4．4 微卫星DNA分析

微卫星DNA又称简单重复序列( simple sequence repeat，SSR) ，广泛分布于生物体整个基因组中，具有数量多、多态性丰富、保守性强、共显性遗传、进化承受选择压力小，操作简单、重复性好和检测结果准确等优点[6]。

微卫星DNA分析法是近十多年来发展起来的一种新兴分子遗传标记。微卫星分子标记是共显性标记，较其他分子标记方法相比，有更高的个体特异性和可重复性，在生物群体进化研究、核基因组研究、遗传连锁图谱的构建、亲缘关系鉴定、基因定位、品种鉴定等领域已得到广泛的应用。

1．4．5 DNA分子杂交技术

分子杂交（molecular hybridization）的基本原理是待测的单链核酸序列与已知序列的单链核酸（探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA 与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30～50核苷酸长，探针必须预先标记以便检出杂交分子。标记通常为同位素标记法和生物素标记法。

分子杂交方法可分为液相杂交和固相杂交法。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固相杂交法最为常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，是一种研究最早且操作复合的杂交类型，应用不如固相杂交那样普遍。主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。

核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。

1．4．6 裂解酶片段长度多态性(CFLP)技术