皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备

皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架

材料的制备

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

【摘要】探索一种较理想的皮质骨I型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料。［方法］以牛皮质骨为原料，经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉。通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉，经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原，SDS PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征；再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料，扫描电镜观察其内部结构。［结果］所得胶原经SDS PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合I型胶原特征；制备的支架材料外观呈圆柱状，内部为孔径均匀平行排列的微管结构，具有仿生效果。［结论］皮质骨中能够获得纯度较高的I 型胶原，可用于胶原材料的制作。

【关键词】组织工程胶原提取神经支架

Abstract：［Objective］To develop an ideal method for extracting type I collagen from cortical bone and to prepare a collagen gelatin scaffold.［Method］The cortical bone was disintegrated into bone matrix powder in a high speed mill and

was subsequently dehydrated in alcohol,decalcificated in hydrochloric acid and defatted in chloroform:methanol (1:1,v/v).The osscins were extracted using improved pepsin digestion method after the bone matrix powder was dissolved,centrifuged,dialyzed and lyophilized. Type I collagen was then characterized by SDS PAGE and amino acid composition analysis. The biomaterial was made of type I collagen and gelatin using freeze drying method,and the alignment regularities of microscopic channels and their course directions were observed under the scanning electronic microscope.The size of the micropores and the factor of porosity were also measured. ［Result］ The collagen extracted was confirmed to be type I collagen by SDS PAGE and amino acid composition analysis. All the scaffolds looked like circular cylinder,the microscopic channels were arranged in parallel manners,and the pore sizes of the channels were uniform.［Conclusion］Ossein extracted from cortical bone is a real type I collagen that can be applied in the construction of collagen products.

Key words：tissue engineering; collagen; extraction; nerve scaffold

周围神经缺损后的修复再生和功能恢复一直是神经科学领域的难点

和热点。由于周围神经结构和功能上的特殊性，损伤后大多数情况下无法直接对拉吻合，自体神经移植又有诸多限制，因此寻找一种神经替代物来修复缺损是十分必要的。近年来，随着组织工程技术的发展，用于神经修复研究的材料品种越来越多。目前Ⅰ型胶原蛋白制品为组织工程修复神经研究中应用较多的生物材料之一［1］。Ⅰ型胶原通常来自牛腱、鼠尾或皮肤，由于上述组织中含有大量其它种类的胶原和非胶原成分，提取及纯化工艺复杂。骨中Ⅰ型胶原含量丰富，占骨基质中有机成分的95％以上，本实验将传统的酶提取法加以改进，提取牛皮质骨中I型胶原并制备神经支架材料。

1 材料与方法

1.1 骨基质粉的制备

取新鲜牛长骨，去除软组织、骨膜、骨端松质骨及骨髓，然后将皮质骨劈成骨块，乙醇 (60％、70％、80％、90％)梯度脱水，液氮冷冻后放入高速组织粉碎机中，粉碎为直径0.6～2 mm骨粉，持续搅拌下加入甲醇：氯仿(1∶1，v／v)脱脂48 h，每24 h换脱脂液1次;0.6 mol／L盐酸脱钙84 h，分别于第12、36、60 h换脱钙液，脱钙结束后去离子水洗涤3次备用。

1.2 胶原的提取

将50 g牛皮质骨基质粉浸在500 ml 0.05 mol／L冰醋酸和500 mg 胃蛋白酶混合溶液中，持续搅拌96 h。待混合物变为无色、透明、粘稠液体后高速低温离心20 min(10 000 r／min)，以去除未溶解杂质。其上清即为液态粗制胶原。在上清中缓慢加入NaCl，搅拌过夜，

离心20 min(15 000 r／min)，去上清，沉淀物加入0.5 mol／L冰醋酸溶解，离心20 min(15 000 r／min)，取上清加入5 mol／L NaOH 调pH至7.3，缓慢加入NaCl，搅拌过夜，离心20 min(15 000 r/min)，去上清，沉淀物加入0.5 mol／L醋酸中透析溶解，离心10 min(15 000 r/min)，去沉淀，上清装入透析袋中持续透析72 h，每4 h更换透析液1次。最终收获无色透明粘性液体，浓缩冻干。以上液体及操作在4～7℃进行。

1.3 支架材料的制备

称取样品150 mg、明胶(Sigma公司)75 mg溶于0.05 mol／L冰醋酸溶液，4℃条件下搅拌90 min(18 000 r／min)，负压抽真空后于4℃冰箱中过夜，充分混合成凝胶状悬浊液后将其注入长10 cm、内径3 mm 的硅胶管中，密封两端，顺轴向以自制微型调速仪以2×10-5 m／s 的速度浸入冷凝剂中，将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40℃、100 mTorr条件中冻干48 h，制得干燥成形的胶原蛋白支架材料［2］。材料用戊二醛交联，60Co消毒密封备用［3］。

1.4 胶原的鉴定

1.4.1 取样品2 μg溶于420 μl加样缓冲液(1 mol／L Tris HCl 缓冲液，10％SDS，2％巯基乙醇，50％甘油，微量溴酚蓝)过夜，100℃，5 min，离心10 min(12 000 r/min)，取上清20 μl加样，进行SDS PAGE垂直平板电泳，浓缩胶5％，分离胶8％，电极缓冲液SDS Tris甘氨酸系统，浓缩胶电压40 V，分离胶电压80 V，0.25％考马斯亮蓝R250染色，以牛腱I型胶原标准品(Sigma公司)作为