抗体的提取与纯化

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抗体的提取与纯化

(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化IgG；离子交换层析)

精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。

一、盐析法

取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。

↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。

取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。

影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。

二、冷酒精沉淀法

分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA 和IgM。

表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件

物种 pH 沉淀条件 IgG产量

酒精浓度（%）离子强度

人 5.1 15. 0.01 65

山羊 5.2 0 0.01 65

家兔 5.2 10 0.01 70

大鼠 5.0 15 0.01 50

豚鼠 5.1 15 0.01 70

三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白

原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而

其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.

（一）操作步骤

1．DEAE-Sephadex

A-50预处理称DEAE-SephadexA-50（下称A-50）5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/LNaOH 再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。

2．装柱

（1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

（2）将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

（3）关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

3．平衡

启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。

4．加样及洗脱

启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/min。

5．收集

开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

6．测蛋白

以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。

7．合并、浓缩

将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG（MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。

8．A-50凝胶的再生

在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。

（二）注意事项

（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。

（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。