蛋白质的提取、分离纯化及定量

实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验目的
1.学习氨基酸纸层析的基本原理。

2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。

实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。

将样品点在滤纸上（原点），进行展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进行分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA分离开来，形成距原点距离不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率用比移（rate of flow ,R f）来表示
R f= 原点到层析点中心的距离（X）/原点到溶剂前沿的距离(Y) 只要条件（如温度、展层剂的组成）不变，某种物质的R f值是常数。

可根据R f作为定性依据。

R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

样品中如有多种AA，其中有些AA的R f值相同或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法叫双向层析。

仪器、试剂
1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进行混合得混合液。

将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。

取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。

2、氨基酸溶液
⑴.已知单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、
⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。

3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

4、层析缸、滤纸（14*17）、喷雾器、电吹风
实验步骤
1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。

2.准备滤纸：取层析滤纸（长17㎝、宽14㎝）一张。

在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。

3.点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这8个位置上，干后再点一次。

每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。

4.扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。

将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。

待溶剂上升12㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

5.显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6.计算：计算各种氨基酸的比移（Rf）值。

精讲点播
1. 利用逆流分溶或逆流分配的方法作为分配层析原理的说明：
2.物质的结构与极性对Rf 值的影响
物质的结构不同，其分子的极性不一样，物质在水和有机溶剂两相中的溶解度就不同，分配系数的不同可通过Rf 值反应出来，极性较强的物质，在水中的溶解度较大，其Rf 值就较小，相反极性较弱的物质，在有机溶剂中的溶解度就较大Rf 值就大些，如中性AA 的极性弱于酸碱性AA ，故中性AA 的Rf 值较大。

注意事项、出现的问题及解决办法
1.取滤纸前，要将手洗净，并尽可能少接触滤纸，不得已时只能拿滤纸的一角，平放在洁净的纸上。

2.点样点的直径不能大于0.5㎝，否则分离效果不好，样品用量大会造成“拖尾巴”现象。

3.分离时间短使有些已知氨基酸的Rf 值非常相似，分析时可以辅颜色不同加以区分。

4.样品在原点未移动，是因为展层剂出问题，在展层剂中混入了平衡溶液，因为平衡溶液是放置时间长了的展层剂，展层剂出现脂化现象，使分配系数发生变化。

思考题
1.何谓纸层析法？
2.何谓Rf 值？影响Rf 值的主要因素是什么？
3.怎样制备扩展剂？
4.层析缸中平衡溶剂的作用是什么？
实验二. 酶的特异性（专一性）及影响酶活性的因素
实验目的
1. 掌握检查酶特异性的方法和原理。

2. 了解温度对酶活性的影响。

3.了解激活剂、抑制剂对酶活力的影响。

实验原理
1. 酶的专一性
酶是生物体中一种具有催化功能的特殊蛋白质（传统酶的概念），也常称为生物催化剂。

它与一般催化剂的最主要区别就是具有高度的特异性，即专一性。

根据各种酶对底物的选择程度不同，可分为绝对专一性、相对专一性、立体异构专一性，。

例如唾液淀粉酶属于相对专一性酶，它只能随机作用于淀粉链内部的a——1，4糖苷键，使其分子迅速断裂成较短的链，称为糊精，糊精分子量递减，淀粉——大分子糊精——中分子糊精——小分子糊精——简单分子糊精——麦芽糖和a——糊精（含a——1，6糖苷键的短链聚糖，平均分子量为8个残基）。

由于淀粉酶催化所形成的产物都是还原糖，故可用灵敏度较高的Benedict试剂检测和观察。

2.温度对酶促反应速度的影响
酶的催化作用受温度的影响很大，与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度，通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右。

另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。

因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。

反应速度达到最大值时的温度称为酶作用的最适温度。

大多数动物酶的最适温度为37—40℃，植物酶的最适温度为50—60℃。

但一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间称短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。

最适温度不是酶的特征性物理常数。

酶对温度的稳定性与其存在形式有关。

大多数酶在干燥的固体状态与比较稳定，能在室温下保存数月至一年，溶液中的酶，易被微生物污染，常难长期保存，在高温的情况与，如100℃即可失活。

低温降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

3.激活剂和抑制剂对酶活力的影响
酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能增加酶的活性，称为酶的激活剂；另一些物质则会降低酶的活性，称为酶的抑制剂。

例如氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子则为该酶的抑制剂。

通常情况下，很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质对不同的酶所起的作用不同，如镁是脱羧酶烯醇化酶的激活剂，但是肌球蛋白ATP 酶的抑制剂，同一种酶也可因激活剂的浓度不同而作用不同，如CL-在低浓度时是激活剂，达三分之一饱和度时则变为抑制剂。

器材和试剂
1.配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液：
2.新配制的溶于0.3％氯化钠的0.1％淀粉溶液：
3.新配制的溶于0.3％氯化钠的0.2％淀粉溶液：
4.新配制的溶于0.3％氯化钠的1%淀粉溶液：
5.稀释的新鲜唾液。

漱口后将唾液吐入量筒内收集约10ml加水至200ml，取0.2%的淀粉2ml，唾液2ml混匀，每间隔1分钟取1-2滴于白磁反应板内，加KI-I检测，控制酶的浓度使反应刚好在4-5分钟内完成。

6.碘化钾－碘溶液:将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中。

使用前稀释10倍。

7.本尼迪克特（Benedict）试剂: 取86.5克柠檬酸钠（Na3C6O7·2H2O）和50克无水碳酸钠溶于450毫升蒸馏水中；再取硫酸铜（CuSO4·5H2O）8.7克溶于50毫升蒸馏水中；然后将硫酸铜溶液慢慢到入前液，边加边摇动；最后加蒸馏水稀释至
500毫升（本试剂可长期保存）。

8. 1％氯化钠溶液：10、铜溶液：11、%硫酸钠溶液
12恒温水浴锅、沸水浴、移液管、电子天平
操作步骤
淀粉→分子糊精-→中分子糊精→小分子糊精→麦芽糖和α-糊精
KI-I 蓝蓝紫褐红不呈色不呈色
一、酶的专一性
二
（一）淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。

糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。

最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。

在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

(三)
中。

10分钟后取出（将2号管内液体分为两半），用碘化钾－碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。

记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟，再用碘液检验，结果如何？
三. 酶的激活与抑制
（一）
（二）加毕，摇匀，同时置37℃水浴锅中保温，每隔2分钟取液体1滴置白瓷板上用碘液试之，观察那支试管内液体最先不呈蓝色反应，那一管次之，说明原因。

注意事项
1.所用唾液，应在收集前用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏
水，约半分钟后将其流入量筒并稀释。

由于不同人或同一个人不同时间采收的唾液内淀粉酶的活性并不相同，有时差别很大。

所以稀释倍数可根据各人的唾液淀粉酶活性进行调整（一般在50~300倍）。

另外，稀释好的新鲜唾液若泡沫多，可进行过滤后再用。

2.实验中所用的淀粉溶液必须新鲜配制，并且在配制时必须将其煮沸至透明为止。

且下次实验若再用，必须重新煮至透明，否则将影响实验结果。

3.蔗糖是典型的非还原糖，若其中的非还原糖超过一定标准，则呈现还原性，这种蔗糖不能使用。

一般在实验之前要对所用蔗糖进行检查，不能呈现阳性反应，至少要用分析纯试剂。

4.唾液中除了含有淀粉酶以外，还含有少量的麦芽糖酶，该酶可使麦芽糖分解为葡萄糖。

思考题
1．什么是酶的特异性？本实验如何验证了酶的特异性？
2．蔗糖的纯度对该实验的成功与否有什么要求？
3．若将唾液酶和蔗糖酶液煮沸15分钟，其实验结果会发生什么样的变化？4．酶反应的最适温度是酶的特征性物理常数吗？它与哪些因素有关？
参考内容
1.绝对专一性：只作用于一种底物，仅催化一种反应，如脲酶就是其中最典型的例子，只催化尿素水解而对尿素的任何衍生物均无催化水解作用。

2.相对专一性：可以催化某一类的底物或某一类的化学键，如蛋白水解酶脂酶。

3.立体异构专一性：只作用于底物的立体异构物中的一种，而且反应生成物也都是异构物中的一种。

此种现象普遍存在。

实验三小麦萌发前后淀粉酶活性的比较
实验目的
1.学习用分光光度法测定酶活力的原理和方法。

2.了解小麦萌发前后淀粉酶酶活力的变化。

实验原理
淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。

按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α—淀粉酶、β—淀粉酶等. 实验证明，在小麦、大麦、黑麦的休眠种子中只含有β—淀粉酶，α—淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。

其活性随萌发时间的延长而增高。

α—淀粉酶是工业上使用最广泛的酶之一，它在PH3.6下短时间内即可钝化，β—淀粉酶不耐热，加热至70℃以上即可钝化。

利用此原理可以灭活其中一种酶，测定另一种酶的活性。

本实验以淀粉酶催化淀粉生成还原的性糖的速度来测定酶的活力，淀粉水解成还原性糖，还原性糖能使3，5—二硝基水杨酸还原成棕色的3—氨基5—硝基水杨酸。

可用分光光度计法测定，2(C6H10O5)n + n H2→n C12H22O11
器材、材料、试剂
1.小麦种子
2.0.1％标准麦芽糖：精确称量0.1g麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。

3.PH6.9，0.02mol/L磷酸缓冲液：
0.2mol/L磷酸二氢钾：称取磷酸二氢钾溶于水定溶至100ml
0.2mol/L磷酸氢二钾：称取磷酸氢二钾溶于水定溶至100ml
取0.2mol/L磷酸二氢钾67.5ml与0.2mol/L磷酸氢二钾82.5ml混合，定溶至1000ml。

4.0.5％淀粉溶液：
0.5g淀粉溶于0.02mol/L磷酸缓冲液中，加入0.0389gNaCI,用缓冲液定溶至100ml。

5.3，5—二硝基水杨酸溶液：
1g 3，5—二硝基水杨酸溶于2mol/L的NaOH溶液20ml和20ml水中，溶解后移入100ml容量瓶中；30g酒石酸钾钠溶于30ml水中，溶解后移入上容量瓶中，（此时溶液会出现粘稠），继续搅拌，至溶解，定溶至100ml，过滤备用。

6.1％氯化钠溶液：
7.石英砂
8.研钵、恒温水浴、沸水浴、752分光光度计、离心机、电子天平等
实验步骤
一.酶液的提取
1.小麦种子萌发小麦种子浸泡24小时后，放入25℃恒温箱内或在室温下发芽。

2.酶液的提取：
⑴幼苗酶的提取：取发芽4—5天的幼苗10株，放入乳钵内，加石英砂0.2g，加1％氯化钠10ml，用力研磨成匀浆，在0----4℃下放置20分钟。

将提取液移入离心管中，以2000r/min离心10分钟。

将上清液倒入量筒中，测定酶提取液的总体积。

取1ml酶液用PH6.9的磷酸缓冲液稀释10倍，进行酶活力测定。

⑵种子酶的提取：取干燥种子15粒作对照，操作方法同上。

二.酶活力测定：
液2ml。

⑵各管混匀后，放入沸水浴中准确加热5分钟，冷至室温，加水稀释至25ml。

将各管充分混匀。

⑶用空白管作为对照：在A500nm处测定各管的光吸收值（A值或OD值）填入
（5）计算酶活力单位：
根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，A标准/A未知=C标准/C未知
则C（酶管中麦芽糖的浓度）=A
酶×C
标准
/A
标准
设在45℃时3分钟内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个活力单位。

则15粒种子或15株幼苗的总活力单位=C
酶×n
酶×
V
酶
式中C
标准
为标准麦芽糖的浓度
C酶为种子酶或幼苗酶分解淀粉产生的麦芽糖的浓度
N酶为酶液稀释的倍数
V酶为提取酶液的总体积
相关内容
1. 酶的活力：是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性直线关系。

酶催化的反应速率越大，酶的活力越强。

所以测定酶的活力就是测定反应速率。

酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示，在酶活力测定实验中底物往往过量，而产物从无到有，所以实际酶活力测定时一般以测定产物的增加量为准。

2.酶的活力单位：（U，activity unit）
在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量为酶单位。

酶的含量可以用每g酶制剂或与每ml酶制剂含有多少酶单位来表示（U/g或U/ml）
2.在小麦、大麦、黑麦的休眠种子中只含有β—淀粉酶，α—淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。

其活性随萌发时间的延长而增高。

3.α—淀粉酶是工业上使用最广泛的酶之一，它在PH3.6下短时间内即可钝化，β—淀粉酶不耐热，加热至70度以上即可钝化。

利用此原理可以灭活其中一种酶，测定另一种酶的活性。

注意事项
1.实验小麦种子萌发前需充分浸泡24小时，然后均匀的放在铺有滤纸的培养皿或解剖盘中，开始两三天内要需保证水分供应充足，之后根系发达后浇水不可过多。

2.萌发情况不同，酶活力也不同：
刚萌发出胚的小麦，酶活力增加迅速，之后随发芽天数增加继续增加，但幅度减慢，当幼苗生长超过半个月后，酶活力不但不增长，反而下降。

同一天发芽的幼苗高株比矮株的酶活力略高。

3.酶的提取温度在0---4℃时比在25℃时酶活力略高，这是因为低温条件下提取易于保持酶的活力。

思考题
1.为什么提取酶的过程在0---4℃条件下进行？测定酶活性时要在45℃条件下水解淀粉？
2.本实验比较淀粉酶活性时，采用的4支试管各说明什么问题？
3.小麦萌发过程中淀粉酶活性升高的原因和意义是什么？
实验四维生素C的定量测定—2，6-二氯酚靛酚滴定法
实验目的
1.学习定量维生素C的原理和方法
2.掌握微量滴定技术
实验原理
维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此，又称为抗坏血酸。

它对物质代谢的调节具有重要的作用，近年来发现它还能增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有对化学致癌物的阻断作用。

维生素C是具有L-系糖构型的不饱和多羟基化合物，属于水溶性维生素。

它分布很广，植物的绿色部分及许多水果（桔类、草莓、山楂、辣椒等）的含量都很丰富。

维生素C具有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，维生素C易被氧化而破坏。

在中性和微酸性环境中，维生素C能将染料2，6—二氯酚靛酚还原成无色的还原型的2，6—二氯酚靛酚，同时将维生素C氧化成脱氢维生素C。

氧化型的2，6—二氯酚靛酚在酸性溶液中呈现红色，在中性或碱性溶液中呈兰色。

当用2，6—二氯酚靛酚滴定含有维生素C的酸性溶液时，在维生素C尚未全被氧化时，滴下的2，6—二氯酚靛酚立即被还原成无色。

但当溶液中的维生素C刚好全部被氧化时，滴下的2，6—二氯酚靛酚立即时溶液呈红色。

所以，当溶液由无色变为微红色时即表示溶液中的维生素C刚好全部被氧化，此时即为滴定终点，从滴定时2，6—二氯酚靛酚溶液的消耗量，可以计算出被检物质中还原型维生素C的含量。

其化学反应式如下：
（二）材料、试剂
1、新鲜蔬菜或新鲜水果
2、1%草酸溶液
1g草酸溶于100ml蒸馏水中
3、2%草酸溶液
2g草酸溶于100ml蒸馏水中
4、标准维生素C溶液
准确称取20mg纯维生素C 粉状结晶于1%草酸溶液中，稀释至100ml，再取其中10ml稀释至100ml，即得0.02mg/ml的维生素C溶液。

在使用前临时配制。

5、0.02%2，6—二氯酚靛酚溶液
溶解50mg2，6—二氯酚靛酚于约200ml含有52mg的NaHCO3的热水中，冷后稀释至250ml，过滤，装于棕色瓶中，放入冰箱中保存。

使用时用维生素C 标准液标定其浓度。

实验步骤
（一）2，6—二氯酚靛酚溶液的标定：
取5ml维生素C标准液及5ml1%草酸溶液于50ml的锥形瓶中，用配制好的2，6—二氯酚靛酚溶液于微量滴定管中滴定至粉红色出现，并保持15s不褪色，即滴定终点，此时所用染料的体积相当于0.1mg维生素C，由此可求出每ml2，6—二氯酚靛酚溶液相当于维生素C的mg数。

（二）称取新鲜蔬菜或水果（要有大、中、小各部分的代表，洗净，除去不可食部分，切碎，混匀）约10克，于研钵中，加入等体积的2%草酸溶液研磨成浆状，得匀浆液。

将匀浆液移入100ml容量瓶中，可用1%草酸溶液帮助转移，加入30%Zn（AC）2和15%K4Fe（CN）6溶液各5ml，脱色，然后用1%的草酸稀释至刻度，充分摇匀，静止几分钟后过滤。

（弃去最初流出的几毫升溶液）（三）用移液管吸取滤液5或10ml于50ml的锥形瓶中，立即用标定过的2，6—二氯酚靛酚溶液滴定，直至溶液呈浅粉红色15s不褪色为止。

记录所用染料的ml数。

为了避免其它物质的干扰，滴定过程不得超过2min。

（此步骤平行作2—3次）
（一）计算
维生素C含量（mg/100g样品）=（VT/W）×100
式中：V为滴定样品所耗用的染料的平均ml数
T为1ml染料相当于维生素C的mg数
W为滴定时所用样品稀释液中含样品的g数
注意事项
1.整个滴定过程要迅速，防止还原型的维生素C被氧化。

滴定过程一般不超过2min。

滴定所用的染料不应少于1ml或多于4ml，若滴定结果不在此范围，则必须增减样品量或将提取液稀释；
2.本实验必须在酸性条件下进行，在此条件下，干扰物反应进行很慢；
3.提取液中尚含有其它还原性的物质，均可与2，6—二氯酚靛酚反应，但反
应速度均较维生素C慢，因而，滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一滴一滴地加入，并要不断地摇动锥形瓶直至呈粉红色15s不褪色为终点；
4.若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，需脱色，可用白陶土、30%Zn（AC）2和15%K4Fe（CN）6溶液等，本实验用30%Zn（AC）2和15%K4Fe （CN）6溶液脱色，若色素不多，可不脱色，直接滴定。

5.在生物组织和组织提取液中，维生素C还能以脱氢维生素C及结合维生素C 的形式存在，它们同样具有维生素C的生理作用，但不能将2，6—二氯酚靛酚还原脱色.
6. 2%草酸有抑制抗坏血酸酶的作用，而1%的草酸无此作用
思考题
1.指出3—4种维生素C含量丰富的物质。

2.为了准确测定维生素C的含量，实验过程中应注意哪些操作步骤？为什么？
实验五蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验目的
1.学习蛋白质的提取方法。

2.掌握凝胶过滤法使蛋白质脱盐。

3.掌握紫外分光光度法或考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。

实验原理
（一）蛋白质的提取：盐析法或等电点法。

蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态与解离程度受溶液的酸碱度影响，当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称此种蛋白质的等电点。

不同蛋白质各有其特异的等电点，在等电点时，蛋白质的溶解度最低，可用于提取蛋白质。

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）浓溶液能析出蛋白质。

盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。

如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵中析出。

由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆沉淀反应，可用于提取蛋白质。

（二）蛋白质的分离纯化
蛋白质溶液中如含有无机盐离子，用葡聚糖凝胶过滤法可使蛋白质与无机盐分离，效果理想。

葡聚糖凝胶（商品名SepHadex），又称右旋糖苷，它是葡萄糖通过α－1,6－糖苷键形成的长链，与交联剂环氧氯丙烷交联生成（见图）。

在合成凝胶时，控制交联剂环氧氯丙烷的用量，可以制成网孔大小不同的葡聚糖凝胶（见图），即不同规格凝胶。

葡聚糖凝胶从G-10到G-200有多种类型，G 后的数字由每克干胶充分溶胀后吸水的克数乘以十所得，同时也代表网孔大小，G后的数字越小，其溶胀后的网孔越小，一般G-10到G-50适用于蛋白质与小分子或无机盐的分离，G-75到G-200适用于分子量大于一万的蛋白质的分离。

本实验用G-25使蛋白质与硫酸铵分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的
硫酸铵扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒（固定相）的外面，加入洗脱液（流动相）洗脱，因大分子蛋白质从凝胶颗粒的缝隙向下洗脱，阻滞力小，可首先被洗脱下来，故洗脱体积小。

而小分子的硫酸铵因扩散进入凝胶颗粒的网孔中，阻滞力大，需要较大的洗脱体积才能从柱中洗出，这样可使蛋白质与硫酸铵很容易分离开。

（三）蛋白质的定量----考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量考马斯亮蓝G-250是一种能使蛋白质染色的染料，在酸性溶液中，考马斯亮蓝本身呈红褐色，在465nm处有最大光吸收。

加入蛋白质后，该染料能与蛋白质快速结合，生成染料－蛋白质复合物，该复合物的最大光吸收峰移向595nm处，消光系数更大。

蛋白质浓度在一定范围内（1——1000ul/ml）与考马斯亮蓝反应的复合物在595nm处的吸光度与蛋白质的浓度呈直线关系，故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即反应完全，其复合物在1h内保持稳定，
仪器、试剂
1.过硫酸铵
2.纳氏试剂：500ml
将HgI
11.5g溶于无离子水中，稀释至50ml，加入6mol/LnaOH 50ml,静止
2
后取清液储存于棕色瓶中。

3.无离子水（洗脱液）、
4.标准蛋白质溶液
5.考马斯亮蓝试剂称取考马斯亮蓝G-250100mg，加95％乙醇（AR）50ml，溶解后加入85％H3PO4（W/V）100ml，加水稀释至1000ml，保存于棕色瓶中。

6. SepHadexG-25
7.紫外可见分光光度计、
8.离子层析柱、
9.、层析柱固定装置、10.抽滤系统及布氏漏斗
实验步骤
一.蛋白质的提取
取鸡蛋一只，取蛋清加无离子水至50ml，搅拌至成均匀的胶体溶液。

用六层纱布过滤，取1—2ml蛋清溶液于试管中，加入硫酸铵至饱和状态，2000r/min离心10min,去上清液，加入水至沉淀刚好溶解，测量体积。

二.蛋白质的脱盐——凝胶过滤
1.溶胀凝胶
用无离子水浸泡SepHadex G-25 24小时以上（中间换一次水）或用无离子水沸水溶胀2小时左右。

2.凝胶装柱
安装层析装置，将层析柱固定在铁架台上，两端分别连接乳胶管。

上段与洗脱液连通，下端装一螺旋夹调控洗脱速度，先用少量洗脱液洗柱并排除乳胶管中的气泡，待柱中洗脱液维持1cm高度时，拧紧螺旋夹。

将溶胀好的G-25依次倒入层析柱中，使其自然沉降，沉降后凝胶柱的高度为层析柱的3/4~4/5且柱床面平整比较理想。

拧松螺旋夹排除多余的洗脱液，床面上维持1cm高的洗脱液，拧紧螺旋夹。

3.加样洗脱
用刻度吸管吸取1ml样品（蛋白质－硫酸铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间有一清晰界面。

拧松螺旋夹，使样品全部进入凝胶柱中，。