支原体检测PCR方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
PCR法检测支原体
实验原理:
通过对支原体特定的序列设计引物,当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增,会将目标DNA特异性的复制,然后通过琼脂糖电泳观检测,会跑出条带出现阳性结果。反之当没有支原体污染时,由于没有模板,PCR无法扩增,则琼脂糖电泳跑不出条带,出现阴性结果,为确保PCR法的精确性,故需要找到最优的PCR条件在进行检测。
实验目的:
检测培养的细胞是否有支原体污染。
实验材料:
ml EP管;PCR管;镊子;手套;口罩;EP管架;移液枪(100 ul,10 ul)及配套枪头(黄、白);dd H2O;上下游引物(两组);dNTPs;10 x Buffer;Easy Taq;冰盒;琼脂糖;锥形瓶(200ml);量筒(50ml);全套琼脂糖电泳设备(电泳槽,制胶槽,梳子,电源输出);凝胶成像系统;
PCR引物:
LZY-5 Myco universal F:GGGGAATGGGTGAGTAACACG
LZY-5 Myco universal R:CGGATAACGCTTGCGACCTATG
产物大小:500bp
LZY-6 mycotest F :GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT
LZY-6 mycotest R :TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC
产物大小:250bp
实验步骤:
1、取样:
直接取培养细胞的培养基上清。
2、PCR(为25ul体系)
1、配制反应体系,根据检测样本数+1个阴性对照(水)+1个阳性对照,算出PCR 样本的个数,在此基础上增加几管的量,把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起,混匀后分装,最后加入检测培养基。
3.琼脂糖凝胶的制备
1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。