银染经验谈

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银染是一种常用的蛋白质染色方法,具有较高的灵敏度,可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。

虽然这是protocol上的说法,但如果操作得当,检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。

如果搜索银染的protocol,可能会得到许多种说法。

为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢?这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。

简单的讲,银染的原理就是将银离子还原,附着在蛋白表面,形成染色。

银染所用的银,基本上是基于两种试剂,一种是硝酸银,另一种是Silver diammine。

基于硝酸银的应用要多于后者(据说Silver diammine比较费“银子”),现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。

银离子容易被还原,在PAGE胶上,哪里的银离子先开始被还原,哪里就先开始出现条带。

通常由于蛋白质结构上的复杂性,一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合,所以有蛋白的地方银离子较少,如果不做任何处理,有蛋白的部位将会染色更浅,所以最初的银染是负染。

那最初的负染是如何演变成正染色的呢?一方面是选用还原速度较慢的还原剂,如甲醛,另一方面,利用慢还原争取到的时间将胶上多余的银离子洗去,由于银离子对蛋白质有一定的结合力,故更多地保留在有蛋白的位置,于是形成了正染。

但是这种染色的方法灵敏度还不是很高,所以人们又在染色之前加入了敏化的步骤,能够使银染敏化的试剂很多,一类是增加蛋白质与银离子的结合位点,如SDS等;还有一类能使银离子和蛋白形成silver sulfide等结合,硫代硫酸盐起到的就是这个作用;还有的试剂兼顾上述两种功能,如戊二醛。

通过敏化过程,银染的灵敏度大大增加,同时也降低了背景。

综上,银染的原理概括如下:让银离子尽可能多的于蛋白结合,尽可能的洗掉胶上的银离子,然后还原显色。

各种各样的protocol基本上都是基于这个原理。

最为经典的一个版本是这样的:
谈谈其中一些具体步骤:
1. 固定,固定的作用主要是使蛋白变性,防止蛋白在扩散
2. 敏化,戊二醛和硫代硫酸钠都是增加蛋白和银离子的结合,但是做质谱兼容银染
的时候一般都把戊二醛去掉,原因是对蛋白造成修饰(在我的实验中,有戊二醛存在的时候一般也能鉴定到蛋白,不知道是不是去掉更好)。

乙酸钠的作用应该是缓冲pH。

3. 染色,有的protocol中这一步不加甲醛,不加甲醛是后面的显色速度将大大降
低。

4. 显色,碳酸钠的作用是提供碱性环境,在碱性环境下甲醛才能发挥它的慢还原特
性。

这一步中的硫代硫酸钠有增加银化合物溶解的能力,防止氯化银在胶表面形成薄膜,但是在质谱兼容银染中,硫代硫酸钠也是省去的。

5. 终止,顾名思义,显色成功后终止反应。

评价好的银染方法主要基于以下几个方面:灵敏度,重复性,速度。

个人认为平衡好灵敏度和重复性是实验的关键,速度可以放在后面考虑。

如果不知道哪个版本的银染更为合适,那么上面的那个经典版本是个不错的选择,之后可以根据具体的结果,并参考银染的原理做些优化。

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