实验2凝集反应-ELISA备

管底形成大片凝集物。
＋＋＋： 液体基本澄清，细菌大部分凝集（75%左右）， 管底的凝集物稍小。
＋＋：
液体半澄清，稍显浑浊（凝集物50%左右）， 但仍可见明显凝集块。
－： 液体浑浊，无凝集块，轻摇试管，有细菌呈
线状浮起。
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效价：抗原抗体反应时，发生明显反应的最高 血清稀释度，又称滴度。
凝集效价：凝集反应时，能使50%或以上的抗 原发生凝集的最高血清稀释度。
O
AB
型
型
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注意事项
用牙签研磨时，注意防止将抗A血清带到抗 B血清中，反之亦然。
如果凝集现象不太明显时，可用显微镜观察。
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免疫标记技术
将已知抗体或抗原标记上易示踪物 质（如酶、荧光素、放射性同位素、胶 体金等），通过检测标记物来反映有无 抗原抗体反应，从而测出微量的抗原或 抗体。
免疫学实验课
贵阳医学院免疫学教研室
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Βιβλιοθήκη Baidu 实验内容
1、试管凝集反应（示教） 2、ABO血型鉴定--玻片凝集反应（1份/1人） 3、乙型肝炎病毒表面抗体检测--ELISA法(1份/1人）
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实验二 凝 集 反 应 （Agglutination）
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实验原理
颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应的抗体， 或可溶性抗原/抗体吸附于与免疫无关的载体，形成 致敏颗粒，与相应抗体/抗原在一定的条件下，形成 肉眼可见的凝集小块的反应，称为凝集反应。参与 反应的抗原称凝集原（agglutinogen），抗体称为 凝集素（agglutinin）。
反应板中各加入待测标本1滴，同时设阴性、阳性、空白对照孔(NS) （反应板已用纯化HBsAg包被 ）
每孔加入酶结合物1滴，37℃孵育30min
手工洗板，弃液拍干，重复5次
每孔加入显色剂A液、B液各1滴，置37℃孵育15分钟
每孔加入终止液1滴，混匀
目测法：与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅判断结果
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实验报告
玻片凝集反应-ABO血型鉴定 酶联免疫吸附试验间接法（间接ELISA）
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凝集反应类型
直接凝集反应（direct agglutination） 颗粒性抗原与相应抗体直接结合，所出现的凝
集现象，包括试管凝集反应、玻片凝集反应。
间接凝集反应 （indirect agglutination） 将可溶性抗原（或抗体）吸附在与免疫无关的
载体颗粒表面，使此形成致敏颗粒，然后再与相应 抗体（或抗原）混合，在适当条件下，发生凝集现 象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。
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实验五 酶联免疫吸附试验
（Enzyme Linked Immunosorbsent Assay,ELISA）
【原理】 利用标记技术将酶标记到抗体（抗原） 上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记 抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的 酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。 根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异 的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直 接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。
取上清用于ELISA实验
5. 取红细胞悬液用于ABO血型鉴定 6. 取已加有抗A血清与抗B血清载玻 片1张，分别加入待测抗原各1滴， 并用牙签混匀。 7. 置室温5 分钟左右观察结果。
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ABO血型鉴定的判断
抗A型标准血清 抗B型标准血清 抗A型标准血清 抗B型标准血清
A
B
型
型
示意图
抗A型标准血清 抗B型标准血清 抗A型标准血清 抗B型标准血清
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
1:20 1:40 1:80
1:160可编辑ppt 1:320
1:640
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3.每管加伤寒杆菌“H” 抗原0.5ml。 4.混匀，置 52℃水浴4h，取出后，置
室温过夜，次日读取凝集效价。
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结果观察
不同程度的凝集现象：
＋＋＋＋：液体澄清，细菌全部凝集（100%），沉于
【测定原理】
采用纯化HBsAg包被反应板，加入待检标本，当 标本中存在抗- HBs时，该抗体与包被HBsAg结合， 再加入酶标羊抗人IgG抗体。最后形成HBsAg-抗 HBs-酶标抗抗体复合物，加入底物产生显色反应。
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【 步 无菌采血，离心2000rpm,3min，取上清作为待测标本(见玻片凝集实验) 骤 】
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（一）试 管 凝 集 反 应
操作步骤
于试管架上列7支试管。
1.每管内分别加入生理盐水0.5ml。 2.血清稀释：第一管加入1:10待检血清0.5ml，混匀 后取0.5ml，加入第二管内，依此类推，直到第6管， 混匀后从第6管中吸出0.5ml弃去；第7管为对照管。
0.5ml
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（二）玻片凝集反应
已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻 片上，在一定的条件下，若两者相对应，则会 发生凝集。本方法主要用于抗原的定性分析， 如菌种鉴定、ABO血型鉴定等。
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ABO血型系统
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ABO血型鉴定步骤
红细胞悬液的制备（用于血型鉴定及ELISA实验） 1. 取EP管1支，加入5滴生理盐水 2. 消毒耳垂或手指皮肤 3. 用采血针采1-2滴血，加入盛有生理盐水的EP管中混匀 4. 2000rpm，离心3min
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直接ELISA
包被(未知抗原）
间接ELISA 双抗体夹心法
包被(已知抗原）
包被(已知抗体）
加入酶标抗体 洗板
加底物 加终止液
加入待检标本 （未知抗体） 加入酶标第二抗体 ﹙抗抗体﹚
洗板
加底物
加终止液 可编辑ppt
加入待检标本 （未知抗原）
加入酶标抗体
洗板 加底物 加终止液
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乙型肝炎病毒表面抗体的检测 ——间接ELISA法