乳酸菌活性测定具体操作步骤

乳酸菌活性测定具体操作步骤

一、培养基的配制：

改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)

番茄汁50mL

酵母抽提液5g

肉膏10g

乳糖20g

葡萄糖2g

K2HPO4 2g

吐温80 1g

乙酸钠5g

琼脂15g

水加至.1000mL pH6.8±0.2（用10mol/l的氢氧化钠调节）

番茄汁的制作：将新鲜番茄洗净，切碎(切勿捣碎)，放入三角烧瓶，置4℃冰箱8～12h，取出后用纱布过滤即成。如一次使用不完，可将其置入0℃冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。

制法：将所有成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.8±0.2。分装烧瓶，高压灭菌121℃15～15min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。

二、器材

lm1无菌移液管，无菌平皿，无菌试管，塞子，试管架，酒精棉、70~75%酒精、酒精灯、镊子、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等，电子天平，洗耳球，三角瓶，烧杯等。

三、操作步骤（实验步骤按实验操作进行增减）

l．编号：（每个样的操作按下表进行编号和操作）

注：酸奶由一个组成员做即可，酸奶稀释倍数要做到10-8。平板上还需标明班级，组号，样品种类（分瓶中和管内）。其中倒平板时酸奶做6、7、8三个梯度，酸奶粉做2、3、4三个梯度（根据具体情况定）。酸奶粉做2个平行，原酸奶做3个平行。

2．配置酸奶奶粉溶液：

以无菌操作(即在超净工作台上操作，电子天平、称量纸、药匙、事先放入超净工作台上紫外杀菌30min)称取1g 奶粉溶解于10-1试管无菌生理盐水中配成1：10的均匀稀释液。将10-1试管置试管振荡器上振荡（此处由于实验条件有限，盖住硅胶塞，右手左右晃动震荡即可），使菌液充分混匀。

酸奶则吸取1ml溶解于另一支10-1标号无菌生理盐水中配成1：10的均匀稀释液。

3、稀释

用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的1：10的奶粉溶液(待测样品)沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的标号10-2试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。

另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。稀释到所需倍数即可。原液酸奶的稀释同此过程。

（放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。此稀释过程如用移液枪做更好。）

4、取样

用三支1mL无菌吸管分别吸取10-3、10-4和10-5的酸奶粉稀释菌悬液各lmL（酸奶稀释液吸取10-6、10-7、10-8三个梯度），对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放1ml。（分几次滴于平皿，使其均匀的摊在平皿底部）

5、倒平板．

稀释液移入平皿后，应及时将冷至45~50℃的改良TJA培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。

用1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min。

待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养培养72±3h。

注：其中接种方法可用浇混接种、涂布接种或用夹层法。乳酸杆菌最好在厌氧环境下培养。

6、观察计数：

观察乳酸菌菌落特征，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。

本次试验选取乳酸菌菌落容易计数的平板进行计数。

（乳酸菌菌落形态：圆形，表面光滑，中央凸起或者扁平的乳白色和乳黄色菌落。）

则1mL检样中乳酸菌数为：(N1+N2+N3)*A/3

注：

单位是：个/g 或者个/ml

N1、N2、N3-------平行平皿中乳酸菌落个数

A--------稀释倍数（如选取的是10-2的平板中的菌落数，则A=100）

注：由于时间原因，此次试验只需数培养皿中菌落的个数，然后对比1ml 酸奶和1g奶粉中乳酸菌的含量。