第3次课 天然产物研究实验室技术1(提取)
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天然产物化学
天然产物研究实验室技术 Ⅰ
生物科学与工程学院 生化与分子生物学
Natural Product Chemistry
天然产物化学
要求掌握的内容
1、中药或民族药物防病治病的物质基础是天然药
物中的活性成分；
2、溶剂提取法的基本原理：相似相溶原理；
3、掌握常用溶剂的极性大小及各自的特点；
4、掌握溶剂极性梯度系统分离法；
不锈钢板 (60*60 cm) ；厚度：5 mm 上样量 ＞10 g
带浓缩带TLC
二维TLC 多次展开（同方向） 双向展开
天然产物化学
加压薄层色谱OPLC（Overpressure Layer Chromatography）
又称 Overpressure TLC (OPTLC) 1、简介 1979年，HPTLC 吸收HPLC的某些特点： 平面、细颗粒、蒸气相、恒流速
天然产物化学
天然产物化学
天然产物化学
天然产物化学
2 方法 色谱法（平面色谱、柱色谱、逆流色谱） 结晶
天然产物化学
平面色谱
薄层色谱TLC (Thin Layer Chromatograph) 功能：定性分析（预试、指导分离) 对照—标准品 种类：硅胶G, GF254 、RP-18 、聚酰胺 显色：通用—碘、H2SO4/EtOH 专属—alkaloids, flavonoids
天然产物化学
第三章
（2）生物活性多样性
1. 研究历史悠久：吗啡、毛地黄毒苷、麻黄碱 ，利血平是早期从民间药物中开发出来的； 2. 植物粗提物的活性优于单一成分（成分间的 协同作用），说明复方研究的重要性。
2016/5/9
14
天然产物化学
第三章
（3)有效成分可变性
影响有效成分含量的因素有：植物器官、植物生长 环境、生长季节、海拔等； 采收、干燥、储存和提取分离方法对有效成分的含 量也有影响。
天然产物化学
3、流动相选择 三角形法则
4、样品的收集洗脱 显色：定位 转移 洗脱
天然产物化学
5、PTLC制备样品时引入的杂质 粘合剂 杂质 指示剂 Other (分解物) (Al2O3 作吸附剂) 解决办法：Sephedex LH-20
天然产物化学
天然产物化学
6、TLC技术的发展 HPTLC 巨形板TLC
"硅胶H"-不含粘合剂；"硅胶G"-含煅石膏粘合剂；"硅胶HF254"-含 荧光物质，可用于波长为254nm紫外光下观察荧光；"硅胶GF254"既含煅石膏又含荧光剂.
天然产物化学
天然产物化学
实例：紫杉醇和三尖杉宁碱分离中的跟踪检测 展开剂：二氯甲烷－正己烷－甲醇－三乙胺 （3.5:4.5:0.5:1）
Natural Product Chemistry
College of Biological Sciences and Engineering
天然产物化学
一、提取分离的意义：
概
述
2016/5/9
7
天然产物化学
二、提取分离的前期工作
2016/5/9
8
天然产物化学
三、综合运用多种分离方法和手段
先运用不同溶剂提取分离，将主要成分或易分 离的成分或有效部位提取出来，并结合简便有效的 化学、色谱及生物检测手段指示追踪分离； 对于含量低、活性高的成分则可通过柱色谱 (CC)、制备薄层色谱（PTLC）、高效液相色谱（ HPLC）等方法分离。
College of Biological Sciences and Engineering
天然产物化学
Natural Product Chemistry
College of Biological Sciences and Engineering
天然产物化学
粗
分
细 分
天然产物化学
二、分离
1 分类 粗分（部位分离） 细分（部位分组） 单离（单体成分分离）
CHCl3(弱 碱 性 Alk) 精 制 除脂杂
回收氯仿，蒸干，溶于无水乙醇 加 H2SO4调 pH=3.8~4.1， Alk沉 淀 Alk硫 酸 盐 溶 于 H2O， 氨 水 碱 化 至 pH=8~9 CHCl3萃 取 H2O
除水杂
CHCl3 回收氯仿 色 谱 法 分 离 游 离 Alk(混 合 碱 )
2016/5/9
2
天然产物化学
5、掌握两相溶剂萃取法的原理及影响因素； 6、掌握分配色谱、吸附色谱、凝胶色谱和离子交换 色谱的工作原理 7、掌握提取分离过程中人工修饰物的常见条件和因 素。 8、天然产物结构鉴定方法
2016/5/9 3
天然产物化学
巴马亭粗品 80-90%EtOH回流
不溶物
EtOH液 加HCl调pH=2-3 放置，过滤
溶 于 苯 ： 氯 仿 (1:2)液 中 通 过 Al2O3吸 附 柱 用 苯 :氯 仿 (1:2)洗 脱 醛基长春碱
College of Biological Sciences and Engineering
长春碱
Natural Product Chemistry
天然产物化学
总生物碱 H+/H2O(2%H2SO4、 2%酒 石 酸 等 ) 不溶物 H+/H2O 有机溶剂萃取 (CHCl3、 苯 等 ) 有机溶剂 (弱 碱 性 Alk) 1~2%NaOH萃 取 H+/H2O (中 强 、 强 碱 性 Alk) 氨 水 调 pH=9~10 有机溶剂萃取 OH-/H2O NH4Cl/有 机 溶 剂 有机溶剂 酚性 弱 碱 性 Alk 有机溶剂 有机溶剂 非酚性 弱 碱 性 Alk OH-/H2O NH4Cl/CHCl3 CHCl3 非酚性 叔胺Alk 水溶性Alk 酚性叔胺Alk 1~2%NaOH 萃取 pH > 12 n-BuOH萃取 有机溶剂 n-BuOH OH-/H2O 两种途径 酸化 加生物碱沉淀剂 过滤 沉淀
析晶 （盐酸巴马亭）
滤液
加硫酸、锌粉，加热（干燥、氢化） 不溶物 热滤液 冷却，过滤 四氢巴马亭硫酸盐 热溶75%EtOH中，趁热过滤 滤液 加氨水调pH=8.5-9，过滤 四氢巴马亭
不溶物
Natural Product Chemistry
College of Biological Sciences and Engineering
O O
O O O OH
NH OH
O
HO O
H O O O O
注意事项： 多元展开剂不能反复使用，须即配即用； 严格控制组分比例； 预饱和10min，减少边缘效应
天然产物化学
天然产物化学
制备薄层色谱PTLC（Preparative TLC） 功能：制备（ 达g 级） 1、吸附剂（adsorbents） 材料：Silica gel 尺寸：20*20, 20*40 cm 厚度：0.5-2 mm 2、样品带 手工、自动点样器 样品带宽的解决方法： 用极性流动相展开约2cm，使带变窄 用带浓缩带的板子
天然产物化学
4 提取方法（根据提取目的、要求和条件选择） 冷浸法（3-4次） 渗漉法：热不稳定物、可按极性梯度提取 煎煮法（3-4次） 回流提取（3-4次） 连续回流提取法 超临界流体萃取 超声波提取 微波提取
天然产物化学
天然产物化学
天然产物化学
Natural Product Chemistry
天然产物化学
有 机 溶 剂 提 酸 溶 碱 化
除 水 杂
长 春 花 全 草 （ 干 粉 80目 ） 苯渗漉 苯渗漉液 药渣 强碱成盐 弱碱游离
用 酒 石 酸 （ 6%） 水 液 萃 取 除 脂 杂 苯液 H+/H2O(pH=4)
碱性较强的被除去
过 滤 ， 氨 水 碱 化 至 pH=6~7 CHCl3提 取 H2O
2016/5/9 9
天然产物化学
非洲卵叶美登木 (Maytanus ovatus) KB细胞为导向 美登碱(maytansine) 广西美登木 ( M. guangxiensis)
2016/5/9 10
天然产物化学
§1. 有效成分的特征 第三章 （1）概述：成分复杂
糖类、蛋白质、脂类、叶根素、树脂、鞣 质、无机盐等（多为无效成分） 生物碱、萜类、黄酮、香豆素等次生代谢 产物含量低，但生物活性广泛 。
2016/5/9
15
天然产物化学
提取
1 文献 2 系统预试→化学成分种类 3 提取溶剂（根据目的成分选择）
水（鞣质、糖类、蛋白质） 冷水、热水 HCl、NaOH →成盐溶出 醇 （乙醇、甲醇） 95% → alkaloids 60-70% →皂苷、黄酮苷 40-50% → 强心苷 丙酮、乙酸乙酯、氯仿等（苷元）
天然产物化学
2、特点 与传统PTLC比较 效率 50 mg~0.5 g ；1 h 3、制备型OPLC 联机检测、分段收集 4、应用 氨基酸，多肽，胡萝卜素，生物碱等
天然产物化学
Natural Product Chemistry
Click to edit company slogan .
Baidu Nhomakorabea
2016/5/9
11
天然产物化学
麻黄（Ephedra equisetina ） 左旋麻黄素（l-ephedrine）
止咳平喘
2016/5/9 12
天然产物化学
甘草（Glycyrrhiza uralensis ）
甘草酸(glycyrrhizic acid)
抗炎、抗过敏、治疗胃溃疡
2016/5/9 13
天然产物研究实验室技术 Ⅰ
生物科学与工程学院 生化与分子生物学
Natural Product Chemistry
天然产物化学
要求掌握的内容
1、中药或民族药物防病治病的物质基础是天然药
物中的活性成分；
2、溶剂提取法的基本原理：相似相溶原理；
3、掌握常用溶剂的极性大小及各自的特点；
4、掌握溶剂极性梯度系统分离法；
不锈钢板 (60*60 cm) ；厚度：5 mm 上样量 ＞10 g
带浓缩带TLC
二维TLC 多次展开（同方向） 双向展开
天然产物化学
加压薄层色谱OPLC（Overpressure Layer Chromatography）
又称 Overpressure TLC (OPTLC) 1、简介 1979年，HPTLC 吸收HPLC的某些特点： 平面、细颗粒、蒸气相、恒流速
天然产物化学
天然产物化学
天然产物化学
天然产物化学
2 方法 色谱法（平面色谱、柱色谱、逆流色谱） 结晶
天然产物化学
平面色谱
薄层色谱TLC (Thin Layer Chromatograph) 功能：定性分析（预试、指导分离) 对照—标准品 种类：硅胶G, GF254 、RP-18 、聚酰胺 显色：通用—碘、H2SO4/EtOH 专属—alkaloids, flavonoids
天然产物化学
第三章
（2）生物活性多样性
1. 研究历史悠久：吗啡、毛地黄毒苷、麻黄碱 ，利血平是早期从民间药物中开发出来的； 2. 植物粗提物的活性优于单一成分（成分间的 协同作用），说明复方研究的重要性。
2016/5/9
14
天然产物化学
第三章
（3)有效成分可变性
影响有效成分含量的因素有：植物器官、植物生长 环境、生长季节、海拔等； 采收、干燥、储存和提取分离方法对有效成分的含 量也有影响。
天然产物化学
3、流动相选择 三角形法则
4、样品的收集洗脱 显色：定位 转移 洗脱
天然产物化学
5、PTLC制备样品时引入的杂质 粘合剂 杂质 指示剂 Other (分解物) (Al2O3 作吸附剂) 解决办法：Sephedex LH-20
天然产物化学
天然产物化学
6、TLC技术的发展 HPTLC 巨形板TLC
"硅胶H"-不含粘合剂；"硅胶G"-含煅石膏粘合剂；"硅胶HF254"-含 荧光物质，可用于波长为254nm紫外光下观察荧光；"硅胶GF254"既含煅石膏又含荧光剂.
天然产物化学
天然产物化学
实例：紫杉醇和三尖杉宁碱分离中的跟踪检测 展开剂：二氯甲烷－正己烷－甲醇－三乙胺 （3.5:4.5:0.5:1）
Natural Product Chemistry
College of Biological Sciences and Engineering
天然产物化学
一、提取分离的意义：
概
述
2016/5/9
7
天然产物化学
二、提取分离的前期工作
2016/5/9
8
天然产物化学
三、综合运用多种分离方法和手段
先运用不同溶剂提取分离，将主要成分或易分 离的成分或有效部位提取出来，并结合简便有效的 化学、色谱及生物检测手段指示追踪分离； 对于含量低、活性高的成分则可通过柱色谱 (CC)、制备薄层色谱（PTLC）、高效液相色谱（ HPLC）等方法分离。
College of Biological Sciences and Engineering
天然产物化学
Natural Product Chemistry
College of Biological Sciences and Engineering
天然产物化学
粗
分
细 分
天然产物化学
二、分离
1 分类 粗分（部位分离） 细分（部位分组） 单离（单体成分分离）
CHCl3(弱 碱 性 Alk) 精 制 除脂杂
回收氯仿，蒸干，溶于无水乙醇 加 H2SO4调 pH=3.8~4.1， Alk沉 淀 Alk硫 酸 盐 溶 于 H2O， 氨 水 碱 化 至 pH=8~9 CHCl3萃 取 H2O
除水杂
CHCl3 回收氯仿 色 谱 法 分 离 游 离 Alk(混 合 碱 )
2016/5/9
2
天然产物化学
5、掌握两相溶剂萃取法的原理及影响因素； 6、掌握分配色谱、吸附色谱、凝胶色谱和离子交换 色谱的工作原理 7、掌握提取分离过程中人工修饰物的常见条件和因 素。 8、天然产物结构鉴定方法
2016/5/9 3
天然产物化学
巴马亭粗品 80-90%EtOH回流
不溶物
EtOH液 加HCl调pH=2-3 放置，过滤
溶 于 苯 ： 氯 仿 (1:2)液 中 通 过 Al2O3吸 附 柱 用 苯 :氯 仿 (1:2)洗 脱 醛基长春碱
College of Biological Sciences and Engineering
长春碱
Natural Product Chemistry
天然产物化学
总生物碱 H+/H2O(2%H2SO4、 2%酒 石 酸 等 ) 不溶物 H+/H2O 有机溶剂萃取 (CHCl3、 苯 等 ) 有机溶剂 (弱 碱 性 Alk) 1~2%NaOH萃 取 H+/H2O (中 强 、 强 碱 性 Alk) 氨 水 调 pH=9~10 有机溶剂萃取 OH-/H2O NH4Cl/有 机 溶 剂 有机溶剂 酚性 弱 碱 性 Alk 有机溶剂 有机溶剂 非酚性 弱 碱 性 Alk OH-/H2O NH4Cl/CHCl3 CHCl3 非酚性 叔胺Alk 水溶性Alk 酚性叔胺Alk 1~2%NaOH 萃取 pH > 12 n-BuOH萃取 有机溶剂 n-BuOH OH-/H2O 两种途径 酸化 加生物碱沉淀剂 过滤 沉淀
析晶 （盐酸巴马亭）
滤液
加硫酸、锌粉，加热（干燥、氢化） 不溶物 热滤液 冷却，过滤 四氢巴马亭硫酸盐 热溶75%EtOH中，趁热过滤 滤液 加氨水调pH=8.5-9，过滤 四氢巴马亭
不溶物
Natural Product Chemistry
College of Biological Sciences and Engineering
O O
O O O OH
NH OH
O
HO O
H O O O O
注意事项： 多元展开剂不能反复使用，须即配即用； 严格控制组分比例； 预饱和10min，减少边缘效应
天然产物化学
天然产物化学
制备薄层色谱PTLC（Preparative TLC） 功能：制备（ 达g 级） 1、吸附剂（adsorbents） 材料：Silica gel 尺寸：20*20, 20*40 cm 厚度：0.5-2 mm 2、样品带 手工、自动点样器 样品带宽的解决方法： 用极性流动相展开约2cm，使带变窄 用带浓缩带的板子
天然产物化学
4 提取方法（根据提取目的、要求和条件选择） 冷浸法（3-4次） 渗漉法：热不稳定物、可按极性梯度提取 煎煮法（3-4次） 回流提取（3-4次） 连续回流提取法 超临界流体萃取 超声波提取 微波提取
天然产物化学
天然产物化学
天然产物化学
Natural Product Chemistry
天然产物化学
有 机 溶 剂 提 酸 溶 碱 化
除 水 杂
长 春 花 全 草 （ 干 粉 80目 ） 苯渗漉 苯渗漉液 药渣 强碱成盐 弱碱游离
用 酒 石 酸 （ 6%） 水 液 萃 取 除 脂 杂 苯液 H+/H2O(pH=4)
碱性较强的被除去
过 滤 ， 氨 水 碱 化 至 pH=6~7 CHCl3提 取 H2O
2016/5/9 9
天然产物化学
非洲卵叶美登木 (Maytanus ovatus) KB细胞为导向 美登碱(maytansine) 广西美登木 ( M. guangxiensis)
2016/5/9 10
天然产物化学
§1. 有效成分的特征 第三章 （1）概述：成分复杂
糖类、蛋白质、脂类、叶根素、树脂、鞣 质、无机盐等（多为无效成分） 生物碱、萜类、黄酮、香豆素等次生代谢 产物含量低，但生物活性广泛 。
2016/5/9
15
天然产物化学
提取
1 文献 2 系统预试→化学成分种类 3 提取溶剂（根据目的成分选择）
水（鞣质、糖类、蛋白质） 冷水、热水 HCl、NaOH →成盐溶出 醇 （乙醇、甲醇） 95% → alkaloids 60-70% →皂苷、黄酮苷 40-50% → 强心苷 丙酮、乙酸乙酯、氯仿等（苷元）
天然产物化学
2、特点 与传统PTLC比较 效率 50 mg~0.5 g ；1 h 3、制备型OPLC 联机检测、分段收集 4、应用 氨基酸，多肽，胡萝卜素，生物碱等
天然产物化学
Natural Product Chemistry
Click to edit company slogan .
Baidu Nhomakorabea
2016/5/9
11
天然产物化学
麻黄（Ephedra equisetina ） 左旋麻黄素（l-ephedrine）
止咳平喘
2016/5/9 12
天然产物化学
甘草（Glycyrrhiza uralensis ）
甘草酸(glycyrrhizic acid)
抗炎、抗过敏、治疗胃溃疡
2016/5/9 13