蛋白质及氨基酸的测定
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蛋白质及氨基酸的测定
生物技术第三组
蛋白质存在于一切生物的原生质中，是构
成生物体细胞组织的重要成分，是生命的物 质基础。凡是有生命的物体，无论是动植物 还是微生物，都还有蛋白质。蛋白质与营养 代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、 物质运转和遗传等密切相关，缺乏蛋白质生 物就不能维持生命。人及动物只能从食物中 得到蛋白质 及其分解代谢产物来构成自身蛋 白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也 是食品中重要的营养成分。
定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。
A.样品消化
浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还 原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化 性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还 原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。
B.蒸馏
在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热 蒸馏，生成气态氨。
C.吸收
• 3、消化：先小火慢慢加热（尽量减少气泡，防止泡沫冲 到瓶颈而造成氮损失），待内容物全部碳化、泡沫消失， 升高温度（保持瓶内液体沸腾）至液体变蓝绿色透明后， 再继续加热微沸30min。
• 4、冷却：冷却至室温，小心加入200mL蒸馏水，再加入玻 璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
• 二、蒸馏来自百度文库
• 1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧 瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL 40g/L硼酸 溶液及指示剂2~3滴）
蛋白质是由多种氨基酸结合而成的复杂的高分子 化合物。其中含有的主要化学元素为碳、氢、氧、 氮等，大多数蛋白质还含有硫，某些蛋白质中还 含有微量的磷、铜、铁、碘、锌等元素，但含氮 则是蛋白质区分其他有机化合物的主要标志。
测定食物中蛋白质含量的方法有多种，一般可 分为间接方法和直接方法。
间接方法是通过测定样品中蛋白质的总氮量， 再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量
凯氏定氮法
• 由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。
• 它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定 总有机氮最准确和操作简单的方法之一。
• 适用范围：此法只限于测定总氮量，然后 乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量， 由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物， 因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量。
常量凯氏定氮法 微量凯氏定氮法
• 三、滴定
将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准液直接滴 定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液 用量，同时作一试剂空白，记录空白试验消耗盐 酸标准液的体积。
结果计算：
微量凯氏定氮法
1.原理：同常量凯式定量法 2.仪器：微量凯氏定氮法装置 3.试剂：a,b,c,d,e,f（同常量凯氏定氮法）
3.氧化剂
• 由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损 失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。
• 常用的有：高氯酸，过氧化氢
仪器
A、凯氏烧瓶
规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml
特点：瓶颈长、耐高温
B
、 常 量 凯 氏 定
氮 装 置
试剂
• 1、浓硫酸 • 2、硫酸铜 • 3、硫酸钾 • 4、4%硼酸溶液 • 5、甲基红---溴甲酚绿混合指示剂： 五份0.2%溴甲酚绿、95%乙醇溶液、一份0.2%甲基红乙
半微量凯氏定氮法 自动定氮仪法
常量凯氏定氮法
• 适用范围：适用于各类食品中蛋白质含量 的测定，也是测定蛋白质含量的国家标准 分析方法。
• 一 原理：
• 有机含氮化合物与浓硫酸和催化剂共热消化，氮转化为氨， 再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将 氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴
g.0.01000mol/L盐酸标准溶液 4.测定：a.消化（步骤同常量法）
醇溶液均匀混合 • 6、40%NaOH溶液 • 7、0.1000mol/L盐酸标准溶液
测定
一、消化：
• 1、称量：准确称取固体样品1.00~3.00g（视样品含氮量多 少而定）或吸取液体样品10.0~20.0mL
• 2、试剂混合：小心将样品移入洁净的500mL凯氏烧瓶中， 加入0.50g硫酸铜、10.0g硫酸钾、20mL浓硫酸（小心）， 轻摇匀，安装消化装置，在凯氏烧瓶口放一漏斗，并将其 倾斜放置于放有石棉网的电炉上。
• 2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液， 并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀， 再从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸馏，约 30min
• 3、吸收：硼酸溶液吸收氨后，颜色由淡红色逐渐变成蓝绿色， 收集吸收瓶中馏出液体积约250mL左右
• 4、蒸馏完毕：将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口， 继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以纳氏试剂或红色 石蕊试剂检查氨是否蒸馏完毕。如无氨生成，即可停止加热。
直接方法是根据蛋白质的物理和化学性质，直 接测定蛋白质含量的方法。
测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是 测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之 一，应用广泛。此外，双缩脲法、紫外吸收法、 考马斯亮蓝G-250法、福林-酚法等也常用于蛋 白质含量测定。
蛋白质的测定方法：
凯氏定氮法 双缩脲法 紫外分光光度法 福林-酚比色法 考马斯亮蓝染料比色法
用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。
D.滴定
标准盐酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液
• 为了加速反应进行，我们常需加入一定量加速剂。 按其效果不同可分为：增温剂、催化剂和氧化剂。
1.增温剂
• 当温度低于360°C时，消化不完全，尤其是杂环氮 化物，会导致分析结果偏低。当温度高于410 °C时， 铵盐就会分解，故消化温度最好控制在二者之间。
• 纯硫酸的沸点是340 °C附近，因其温度达不到最适， 则需要添加增温剂，常用的增温剂有：硫酸钾，硫 酸钠，主要原因是消化过程中硫酸不断被分解，水 分不断逸出使硫酸浓度增大。
• 注意：加入量不能过大，温度过高会引起已生成的 铵盐分解释放出氨而造成损失。
2.催化剂
• 其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反 应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点 的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
生物技术第三组
蛋白质存在于一切生物的原生质中，是构
成生物体细胞组织的重要成分，是生命的物 质基础。凡是有生命的物体，无论是动植物 还是微生物，都还有蛋白质。蛋白质与营养 代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、 物质运转和遗传等密切相关，缺乏蛋白质生 物就不能维持生命。人及动物只能从食物中 得到蛋白质 及其分解代谢产物来构成自身蛋 白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也 是食品中重要的营养成分。
定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。
A.样品消化
浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还 原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化 性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还 原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。
B.蒸馏
在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热 蒸馏，生成气态氨。
C.吸收
• 3、消化：先小火慢慢加热（尽量减少气泡，防止泡沫冲 到瓶颈而造成氮损失），待内容物全部碳化、泡沫消失， 升高温度（保持瓶内液体沸腾）至液体变蓝绿色透明后， 再继续加热微沸30min。
• 4、冷却：冷却至室温，小心加入200mL蒸馏水，再加入玻 璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
• 二、蒸馏来自百度文库
• 1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧 瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL 40g/L硼酸 溶液及指示剂2~3滴）
蛋白质是由多种氨基酸结合而成的复杂的高分子 化合物。其中含有的主要化学元素为碳、氢、氧、 氮等，大多数蛋白质还含有硫，某些蛋白质中还 含有微量的磷、铜、铁、碘、锌等元素，但含氮 则是蛋白质区分其他有机化合物的主要标志。
测定食物中蛋白质含量的方法有多种，一般可 分为间接方法和直接方法。
间接方法是通过测定样品中蛋白质的总氮量， 再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量
凯氏定氮法
• 由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。
• 它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定 总有机氮最准确和操作简单的方法之一。
• 适用范围：此法只限于测定总氮量，然后 乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量， 由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物， 因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量。
常量凯氏定氮法 微量凯氏定氮法
• 三、滴定
将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准液直接滴 定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液 用量，同时作一试剂空白，记录空白试验消耗盐 酸标准液的体积。
结果计算：
微量凯氏定氮法
1.原理：同常量凯式定量法 2.仪器：微量凯氏定氮法装置 3.试剂：a,b,c,d,e,f（同常量凯氏定氮法）
3.氧化剂
• 由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损 失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。
• 常用的有：高氯酸，过氧化氢
仪器
A、凯氏烧瓶
规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml
特点：瓶颈长、耐高温
B
、 常 量 凯 氏 定
氮 装 置
试剂
• 1、浓硫酸 • 2、硫酸铜 • 3、硫酸钾 • 4、4%硼酸溶液 • 5、甲基红---溴甲酚绿混合指示剂： 五份0.2%溴甲酚绿、95%乙醇溶液、一份0.2%甲基红乙
半微量凯氏定氮法 自动定氮仪法
常量凯氏定氮法
• 适用范围：适用于各类食品中蛋白质含量 的测定，也是测定蛋白质含量的国家标准 分析方法。
• 一 原理：
• 有机含氮化合物与浓硫酸和催化剂共热消化，氮转化为氨， 再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将 氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴
g.0.01000mol/L盐酸标准溶液 4.测定：a.消化（步骤同常量法）
醇溶液均匀混合 • 6、40%NaOH溶液 • 7、0.1000mol/L盐酸标准溶液
测定
一、消化：
• 1、称量：准确称取固体样品1.00~3.00g（视样品含氮量多 少而定）或吸取液体样品10.0~20.0mL
• 2、试剂混合：小心将样品移入洁净的500mL凯氏烧瓶中， 加入0.50g硫酸铜、10.0g硫酸钾、20mL浓硫酸（小心）， 轻摇匀，安装消化装置，在凯氏烧瓶口放一漏斗，并将其 倾斜放置于放有石棉网的电炉上。
• 2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液， 并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀， 再从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸馏，约 30min
• 3、吸收：硼酸溶液吸收氨后，颜色由淡红色逐渐变成蓝绿色， 收集吸收瓶中馏出液体积约250mL左右
• 4、蒸馏完毕：将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口， 继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以纳氏试剂或红色 石蕊试剂检查氨是否蒸馏完毕。如无氨生成，即可停止加热。
直接方法是根据蛋白质的物理和化学性质，直 接测定蛋白质含量的方法。
测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是 测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之 一，应用广泛。此外，双缩脲法、紫外吸收法、 考马斯亮蓝G-250法、福林-酚法等也常用于蛋 白质含量测定。
蛋白质的测定方法：
凯氏定氮法 双缩脲法 紫外分光光度法 福林-酚比色法 考马斯亮蓝染料比色法
用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。
D.滴定
标准盐酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液
• 为了加速反应进行，我们常需加入一定量加速剂。 按其效果不同可分为：增温剂、催化剂和氧化剂。
1.增温剂
• 当温度低于360°C时，消化不完全，尤其是杂环氮 化物，会导致分析结果偏低。当温度高于410 °C时， 铵盐就会分解，故消化温度最好控制在二者之间。
• 纯硫酸的沸点是340 °C附近，因其温度达不到最适， 则需要添加增温剂，常用的增温剂有：硫酸钾，硫 酸钠，主要原因是消化过程中硫酸不断被分解，水 分不断逸出使硫酸浓度增大。
• 注意：加入量不能过大，温度过高会引起已生成的 铵盐分解释放出氨而造成损失。
2.催化剂
• 其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反 应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点 的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。