蛋白纯化和GST沉降技术

蛋白纯化和GST沉降技术

【原理】

细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。

【应用】

1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用

2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用

【方法】

一、GST融合蛋白的纯化

1、菌种的活化：按1%的量在螺旋管中活化所需菌种，一般50ul的冻存菌接入

5ml的LB中，37℃ 220rpm培养

2、活化的菌种转接1%接种于5mlLB中，37℃ 220rpm培养至OD≈0.4~0.6 之

间，即到达对数生长时期（大约3~4小时）

3、取1ml菌液测定OD值，至OD≈0.4~0.6 之间，则取诱导前1ml，其余的按

1/1000加入诱导剂IPTG ，低温小量诱导30℃ 200rpm，诱导过夜（小于16hr）4、次日取诱导后1ml，诱导前和诱导后各1ml，12000rpm ，离心2mins，弃上

清，加适量的1*PBS,重悬菌液，再加1* loading buffer，混匀，沸水煮10mins, 12000rpm ，离心2mins，SDS-PAGE电泳考马氏亮兰染色

5、如果考染结果显示GST融合蛋白（GST-X）诱导出来，则做大量诱导

6、菌种活化后按1%转接种于100ml LB中，30℃ 200rpm 扩大培养至OD≈

0.4~0.6 之间，即到达对数生长时期（大约3 小时）

7、取1ml菌液测定OD值，至OD≈0.4~0.6 之间，按1/10000 加入诱导剂IPTG ，

低温诱导20℃ 180rpm，制冷系数0.5 ，诱导过夜

8、次日50ml离心管收菌, 4℃ 5000rpm 5mins 离心，每瓶100ml重复离心收

于同一离心管中，大型离心机提前预冷

9、每100ml 菌液沉淀加入10ml A 液重悬

10、超声破碎。大探头，冰浴，频率5~10。超声2~3s停2~3s, 15~20次一个

循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止

11、超声后的细菌裂解液加入到50ml 干净离心管中，4℃ 11000rpm

10mins离心

12、平衡Agrose-beads. 每个干净EP管中加50ul Agrose-beads。再加1ml

A 液，4℃旋转 2~3mins后4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃

上清，重复3次

13、吸取菌液离心上清到50ml 干净离心管，将平衡好的Agrose -beads加

入4℃旋转 4小时左右

14、4℃ 3000rpm/600 g 10mins 离心。移液管吸弃上清，留有1ml左右

时用移液器枪头混匀X-GST-beads，转移至1.5 ml进口 EP 管中，用A 液反复洗50ml 离心管多次至将全部珠子转移至EP 管中。3000rpm/600 g , 5mins,离心,弃上清

15、A 液洗涤X-GST-beads，每次1ml 4℃旋转 10mins后4℃

3000rpm/600 g , 5mins, 离心，吸弃上清，重复3次

16、最后向X-GST-bead 中加入100 ul A 液，4℃保存

17、考染定量：取2ul GST-beads 加入 10 ul 1* loading buffer 混匀，

沸水煮样10mins 。12000rpm 5mins 离心后取上清上样（SDS-PAGE）。

下胶后，考马氏亮兰染色（新考染液2~3 mins，旧的考染液10~30mins ）,脱色2 h左右

二、GST Pull down

1、转染细胞24 小时后，IP buffer裂解，超声破碎。大探头，冰浴，频率5~10。超声2~3s停2~3s, 15~20次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止，12000rpm, 离心2mins, 取上清作样品，取部分作In put,剩下的作GST Pull down

2、根据定量结果取X-GST-beads 加入到IP buffer 平衡，4℃旋转 2~3mins 后4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃上清，重复3次。然后将平衡后的珠子于600ul cell lysis结合孵育4h~过夜

3、4℃，3000rpm/600 g ， 5mins 离心后吸回裂解上清，IP buffer洗珠子，4℃旋转 10mins后，4℃ 3000rpm/600 g 5mins 离心，2~3次。最后用

微量上样器将全部IP buffer 吸弃。

4、向X-GST-beads 其中加入30 ul 1* loading buffer.

细胞裂解液In put 50 ul 中加入 50 ul 2* loading buffer . 沸水

10mins 。12000rpm 5mins 离心后取上清上样进行 SDS-PAGE

5、电泳后进行Western Blot 来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白；也可以将胶考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白。

【注意事项】

1） 该实验设立GST 对照，反应均在4ºC 进行

2） 沸水煮样以前的离心速度不要超过3000rpm ，否则可能将beads 离碎了。

3） 在检测时如果发现GST 对照组也有目的蛋白时，则表明有非特异的结合，这是我们应当在GST Pull down 的第三步多洗几次。

4）GST 对照蛋白的量和实验组的蛋白的应该一样，最好是对照的量比实验组的多一点

【举例】

GST pull down 验证两种已知蛋白质的相互作用

input GST X-GST X-GFP + + +

GST input

Anti-GFP Anti-GFP

Y-GST X-GFP