新型转基因抗除草剂水稻培育

新型转基因抗除草剂水稻培育

杂草危害是制约水稻生产的重要因素。有效防治杂草不仅可以提高水稻产量,而且可以推动新型水稻生产技术发展。

草甘膦和草铵膦是目前使用得最广泛的广谱型除草剂,然而难以直接应用于水稻生产。培育转基因抗草甘膦水稻及转基因抗草铵膦水稻可以提高化学除草效率、降低水稻生产成本,促进直播水稻生产技术发展。

缺乏具有自主知识产权的可应用于商业化生产的抗除草剂基因是制约我国转基因抗除草剂水稻发展的主要原因,挖掘可应用于农业生产的新型抗除草剂基因具有重要意义。本课题以华中农业大学刘子铎教授课题组分离克隆的新型抗草铵膦基因RePAT、新型抗草甘膦基因aroAJsp以及新型抗草甘膦基因

I.variabilis-EPSPS为研究基础,对新型抗草甘膦和抗草铵膦基因进行密码子

优化和人工合成,转入粳稻品种中花11及籼稻品种明恢86,一方面验证这些基因的农业应用潜力,另一方面培育具有商品化潜力的转基因抗除草剂水稻新材料,以期为中国转基因水稻生产储备优良的品种资源。

在研究转基因抗草铵膦水稻方面,对新型抗草铵膦基因RePAT进行进行密码子优化和人工合成(命名为RePAT*),并构建到植物转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化方法将RePAT*转入粳稻品种中花11,获得了 130个阳性转化植株。用1000 mg/L草铵膦喷施T0代转化植株,结果显示80%的转化植株正常生长。

在To代和T2代,对转化植株进行分子检测及农艺性状考查,筛选出2个RePAT*以单拷贝整合在基因间区且农艺性状没有显著变化的转基因株系(PAT7

和PAT11)。对T4代PAT7和PAT11纯合株系进行Southern blot、Northern blot 及3’ RACE检测,结果显示RePAT*在转基因水稻中能稳定遗传及表达,但是

RePAT*在PAT7中转录本异常。

同时在田间考查PAT7和PAT11对草铵膦抗性,结果显示在受到5000 g/ha 草铵膦处理时(相当于农业推荐使用剂量的10倍),PAT7和PAT11的主要农艺性状没有显著改变。根据转基因整合分子特征及草铵膦抗性检测结果最终选择转基因家系PAT11为目标株系。

在T6代,PAT11在受到5000 g/ha草铵膦处理时主要农艺性状不发生改变,这些结果说明新克隆的RePAT*在抗草铵膦作物培育方面具有重要的应用价值,本研究培育的转RePAT*水稻有很好的商业应用潜力。在培育抗草甘膦水稻方面,将新型抗草甘膦基因aroAJ.sp及新型抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS,通过密码子优化(分别命名为aroAJ.sp*和I.variabilis-EPSPS*)、人工合成、载体构建及农杆菌介导的遗传转化等步骤导入粳稻品种中花11。

在3次独立的转化实验中,以aroAJ.sp*和I.variabilis-EPSPS*作为筛选标记基因,抗性愈伤组织形成率接近50%,获得的转化植株阳性率为100%,说明aroAJsp*和I.variabilis-EPSPS*可以作为水稻遗传转化的筛选标记基因。考查T1代含单拷贝aroAJ.sp*或者单拷贝I.variabilis-EPSPS*的中花11草甘膦抗性,结果显示转I.variabilis-EPSPS*中花11相比转aroAJ.sp*中花11对草甘膦具有更高的抗性,I.variabilis-EPSPS*更适合转基因抗草甘膦水稻培育,因此选择用I.variabilis-EPSPS*培育转基因抗草甘膦水稻。

将I.variabilis-EPSPS*转入中花11,获得了1 115个阳性的转化植株,利用Southern blot及反向PCR技术确定在3个转基因株系(ZY21、ZY25和Z Y29)中I.variabilis-EPSPS 以单拷贝形式整合在基因间区。在T3代,通过Northern blot 和 Western blot 证明 I.variabilis-EPSPS*在 ZY21、ZY25 和 ZY29 中

可以表达;对ZY21、ZY25和ZY29纯合家系在三叶期和分蘖期用不同剂量的草甘膦进行处理,结果显示即使被8400 g/ha(相当于农业推荐使用剂量的10倍)草甘膦处理,ZY21、ZY25和ZY29的主要农艺性状与对照相比没有显著性差异。

根据转基因整合分子特征、农艺性状考查结果及草甘膦抗性检测结果最终选择转基因家系ZY21为目标株系。在T5代,ZY21在受到8400g/ha草甘膦处理时主要农艺性状不发生改变,说明ZY21具有产业化潜力。

同时将新型抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*转入优良籼稻品种明恢86,获得了 60株阳性转化植株。利用Southern blot和反向PCR对转基因株系进行鉴定,筛选到3个I.variabilis-EPSPS*以单拷贝形式整合在基因间区的转基因明恢86株系(MY28、MY50和MY51)。

在T3代通过Northern blot、3’RACE和Western blot证明

I.variabilis-EPSPS*在MY28、MY50和MY51中转录本完整,且在根和叶片中稳定表达;通过田间草甘膦抗性试验证明在受到8400 g/ha草甘膦处理时MY28、MY50和MY51主要农艺性状不发生改变。将MY28、MY50和MY51与非转基因不育系Ⅱ-32A进行杂交,其杂种F1代在受到8400 g/ha草甘膦处理时主要农艺性状仍然不发生改变,说明MY28、MY50和MY51可以用于杂交稻生产。

根据农业性状考查结果、分子检测结果及草甘膦抗性检测结果确定1个转基因家系MY28为候选转基因株系用于商业化生产转基因水稻培育。本研究证明新型抗草铵膦基因RePAT*和新型抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*在抗除草剂作物培育方面具有重要的应用价值,新型抗除草剂水稻PAT11、ZY21和MY28有较好的商业应用潜力,对中国转基因水稻发展具有促进作用。