虎杖中白藜芦醇发酵和提取工艺

studies provide a theoretical reference for the fermentation and extraction of resveratrol from Polygonum cuspidatum.
Key words：Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc；resveratrol；polydatin；fermentation
208 2010, Vol. 31, No. 22
食品科学
※工艺技术
1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪 美国 Waters 公司；302 型电热鼓
风干燥箱 山东潍坊医药集团股份有限公司医疗器械厂； FW-177 型中药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司； AB204 型电子天平 瑞士 Mettler Toledo 公司；恒温气 候箱、SHH421-420 型恒温水浴锅 河北航天仪器厂。 1.3 方法
中图分类号：TQ214
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)22-0207-04
虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc)为蓼科多 年生灌木状草本植物，主要分布于我国长江以南各地和 陕西、湖北及四川等地。虎杖含多种有效成分，主要 包括蒽醌和芪类化合物，其中芪类化合物中的白藜芦醇 具有重要生物活性[1-3]。
复 3 次，根据标准曲线计算出样品中白藜芦醇苷及白藜 芦醇的含量，样品色谱图见图 1 。
AUБайду номын сангаас
0.030
0.026
Res-9.226
0.022
0.018
0.014
0.010
0.006 0.002
PDT-3.197
－ 0.002
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
时间 /min
白藜芦醇(Res)化学名 3,4,5- 三羟基 - 二苯乙烯，分 子式 C14H12O3，熔点 256～257℃。易溶于极性溶剂如甲 醇、乙醇、乙酸乙酯等[4-5]。在植物体内主要以白藜芦 醇苷(PDT)形式存在。
目前，虎杖中白藜芦醇提取方法主要有两类，一 类是先提取白藜芦醇苷，然后再利用专一性酶[6-7]将白藜 芦醇苷转化为白藜芦醇，但在提取纯化苷的过程中，原 有的部分白藜芦醇会丢失；另外一类方法是采用专一性 酶[8]或是筛选专一性微生物[9]先将虎杖发酵使白藜芦醇苷 转化为白藜芦醇，然后再提取纯化，虽然避免了虎杖
Fermentation and Extraction of Resveratrol from Polygonum cuspidatum
CAO Liang，ZHOU Jian-jun*，WEI Rui，LIU Yi-hong (School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, China)
1.3.1.2 对照品溶液的制备 精确称量白藜芦醇苷 4.0mg 和白藜芦醇 3.0mg，分
别置于 100mL 容量瓶中，加适量甲醇，超声溶解，再 定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液( 白藜芦醇苷质 量浓度为 40μg/mL，白藜芦醇质量浓度为 30μg/mL)。
将储备液配成 5 个不同质量浓度的混合液作为对照 品溶液：1)白藜芦醇苷质量浓度为 4.00μg/mL，白藜芦 醇质量浓度为 27.00μg/mL 的对照品溶液；2)白藜芦醇苷 质量浓度为 8.00μg/mL，白藜芦醇质量浓度为 21.00μg/mL 的对照品溶液；3)白藜芦醇苷质量浓度为 12.0μg/mL， 白藜芦醇质量浓度为 15.00μg/mL 的对照品溶液；4)白藜 芦醇苷质量浓度为 16.00μg/mL，白藜芦醇质量浓度为 9.00μg/m L 的对照品溶液；5 ) 白藜芦醇苷质量浓度为 20.00μg/mL，白藜芦醇质量浓度为 3.00μg/mL 的对照品 溶液。
1.3.1.4 供试品溶液的制备 精确称取虎杖粉末 10.00g，按照一定的料液比加
水，在恒温培养箱中按照设定的温度发酵，然后将发 酵物按比例加入溶剂，回流提取 3 次，合并 3 次滤液， 精确吸取滤液 1mL，用甲醇定容到 10mL，用 0.45μm 样 品过滤器过滤，待测。
1.3.1.5 含量测定 样品溶液在与标准曲线相同的色谱条件下进样，重
中原有白藜芦醇的损失，但操作繁琐，成本较高。也 有报道[10]利用虎杖中微生物产生的酶进行发酵，但对于 发酵后的提取工艺报道各异。本实验先将虎杖进行自然 发酵，然后重点对提取工艺进行研究，通过优化发酵 条件及提取工艺，为白藜芦醇工业化生产提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 虎杖(经陕西理工学院赵桦教授鉴定)产自秦岭南坡中
图 1 样品液相色谱图 Fig.1 Chromatogram of the sample
1.3.2 试验设计
1.3.2.1 发酵条件的选择 根据瞿卫林[13]的报道和曹庸[14]的专利，选择发酵时
间、温度、料液比为考察因素，设计正交试验进行发 酵条件的选择，并根据最优条件进行验证性实验。因 素水平见表 1 。
Abstract：Objective: To explore the fermentation and extraction processing of resveratrol from Polygonum cuspidatum. Methods:
Polygonum cuspidatum from Hanzhong area was used as the material to explore the optimal fermentation and extraction conditions of resveratrol by orthogonal experiments. Results: The optimal conditions for fermentation were fermentation temperature of 45 ℃,
1.3.1.3 标准曲线的建立 将 5 个不同质量浓度的白藜芦醇苷和白藜芦醇对照
品混合液依次分别进样 10μL，记录峰面积，以峰面积 (Y)为纵坐标、以质量浓度(X)为横坐标，用直线回归方 程的方法建立标准曲线，白藜芦醇苷的直线方程为： Y=34983X+3570(r2=0.99991)，其质量浓度在 4.00～20.00 μg / m L 范围内，线性关系良好；白藜芦醇的直线方程 为：Y=57938X+19801(r2=0.99994)，其质量浓度在 3.00～ 27 .0 0μg /mL 范围内，线性关系良好。
段汉中市留坝县生产基地，先将虎杖切片，4 0 ℃干燥 至质量恒定，用中药粉碎机粉碎成细粉备用。经索氏 提取，HPLC 测定，虎杖中白藜芦醇苷的含量 3.70%， 白藜芦醇含量 0.27%。
甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯)；超纯水 自制；白 藜芦醇苷对照品、白藜芦醇对照品 中国生物制品研究所。
收稿日期：2010-06-23 作者简介：曹亮(1984 —)，男，硕士研究生，研究方向为植物资源开发与利用。E-mail：phas0614@tom.com * 通信作者：周建军(1953 —)，男，教授，硕士，研究方向为生物资源开发利用。E-mail：jjzhou01@163.com
表 1 发酵条件正交试验因素水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing
fermentation conditions
水平
1 2 3
A 发酵时间 /h 24 48 72
因素 B 温度 /℃
35 45 55
material-liquid ratio of 1:3, and fermentation time of 48 h. The conversion rate of polydatin was 96.1% under the optimal fermentation
conditions. The optimal conditions for the extraction of resveratrol were 98% methanol as solvent, solid-liquid ratio of 1:6,
extraction conditions
因素 水平
A 甲醇体积分数 /% B 料液比(g/mL) C 提取次数 D 提取时间 /h
1
50
1:3
1
0.5
2
65
1:4
2
1.0
3
80
1:6
3
1.5
4
98
1:8
4
2.0
2 结果与分析
2.1 发酵条件正交试验 发酵条件正交试验结果和方差分析见表 3、4。
※工艺技术
1.3.1 检测方法
1.3.1.1 液相色谱条件 参考周建军等[11-12]的检测方法：色谱柱 Symmertry-
C18(3.9mm × 150mm)，流动相乙腈 - 水(19.5:80.5)，流速 1.0mL/min，柱温 28℃，检测波长 303nm，进样量 10μL， 保留时间 14min。
※工艺技术
食品科学
2010, Vol. 31, No. 22 207
虎杖中白藜芦醇发酵和提取工艺
曹 亮，周建军 *，魏 锐，刘益红
(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)
摘 要：目的：对虎杖中白藜芦醇的发酵和提取工艺进行研究。方法：以汉中地区的虎杖为原料，通过正交试 验研究虎杖中白藜芦醇自然发酵和提取条件。结果：最佳发酵条件为温度 45℃、料液比 1:3、发酵时间 48h、白 藜芦醇苷的转化率为 96.1%；自然发酵后最佳提取条件为 98% 甲醇、料液比 1:6、提取 3 次、每次 1h，白藜芦醇 的得率达 1.912%；通过发酵和提取，虎杖中白藜芦醇的提取率达 90%。结论：本实验可为虎杖中白藜芦醇的发 酵和提取提供一定参考。 关键词：虎杖；白藜芦醇；白藜芦醇苷；发酵
extraction time of 1 h, and extraction repeat number of 3. The yield of resveratrol was 1.912% under the optimal extraction
conditions. The extraction rate of resveratrol could reach up to 90% through optimal fermentation and extraction. Conclusion: These
C 料液比 (g/mL) 1:3 1:4 1:5 1:5 1:3 1:4 1:4 1:5 1:3 1.556 1.467 1.470 0.089 0.267 0.261 0.349 0.088
A 发酵 时间 /h
24 24 24 48 48 48 72 72 72 1.288 1.593 1.612 0.324 0.426 0.253 0.199 0.227
B 温度 /℃
35 45 55 35 45 55 35 45 55 1.427 1.609 1.455 0.182 0.353 0.216 0.308 0.137
食品科学
2010, Vol. 31, No. 22 209
表 3 发酵条件正交试验设计及结果 Table 3 Design and results orthogonal experiments for optimizing
fermentation conditions
试验 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1(Res) k2(Res) k3(Res) R(Res) k1(PDT) k2(PDT) k3(PDT) R(PDT)
C 料液比(g/mL) 1:3 1:4 1:5
1.3.2.2 提取条件的选择 按最佳发酵条件进行发酵后，选择甲醇体积分数、
料液比、提取次数和提取时间作为考察因素，进行正 交试验，选择最佳提取条件，并根据最佳提取条件进 行验证性实验。因素水平见表 2 。
表 2 提取条件正交试验因素水平 Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing