转录组分析概要

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拼接名词解释
• N50：首先将Unigenes按长度从大到小排列，然 后从最大长度的Unigene进行长度累加，一直到累 加的总长度为所有Unigene总长度的一半，此时的 这个Unigene的长度就是N50，如果这个值比较大， 那么说明拼接得到的Unigene都比较长，比较完整 • N25，N75原理同N50
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e.g. metabolism
•Cellular Component
e.g. nucleus, ribosome
GO富集分析
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KEGG
• KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes – Metabolism – Genetic Information Processing – Environmental Information Processing – Cellular Processes – Human Diseases – Drug Development
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4.
将第3步符合non-coding条件的transcripts与Pfam蛋白功能域数据库进
行比对，将具有蛋白功能域的transcripts进行排除，最终得出LncRNA
transcripts
LncRNA靶基因预测
• Trans方法：序列结合及能量原理 • Cis方法： 基因上下游10K区域
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• Ensemble基因组信息目前是最为全面的一个，使 用较为便捷，尤其在植物方面更为有优势
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UCSC基因组浏览器
在线浏览查找地址：
• http://genome.ucsc.edu/
• 一个强大的工具：Table FTP下载地址
ftp://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/
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GO structure
• Hierarchical • Directed Acyclic Graph
– terms have one or more parents
• is-a and part-of relations
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GO Three function type
•Molecular Function e.g. DNA binding, catalysis of a reaction •Biological Process
转录组分析
孙明明
mingming_sun@shbiochip.com
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转录组分析
• 分析材料收集 • 分析流程概要 • 分析结果展示
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什么是转录组
• 转录组（transcriptome）
– 广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集 合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码 RNA； – 狭义上指所有mRNA的集合
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基因组比对实现方法
第一步：应用bowtie对下载的基因组建立索引 bowtie2-build -f genome.fa genome_index
第二步：应用tophat进行基因组比对 tophat2 -I 50000 --max-segment-intron 50000 -a 10 –m 0 -g 1 –p cpu_cores -G gtf/gff文件 genome_index fastq_1 fastq_2
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转录组
基因组
蛋白质组
代谢组
人 类 生 老 病 死 奥 秘
相应基因组及注释文件查找
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基因组
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基因组注释文件
• GTF：Gene transfer format • GFF：Gene Feature Format)
<seqname> <source> <feature> <start> <end> <score> <strand> <frame> [attributes]
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分析流程
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数据预处理
• • • • • 去除总体质量偏低的Reads 去除首末尾质量低的碱基，<Q20 切除Reads含有的接头序列 去除中间N碱基，标准为连续出现2个N 去除ribosome RNA reads
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拼接 assembly
• • • • • CLC bio Trinity Velvet+Oases SOAPdenovo ABYSS
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UCSC基因组浏览器
注释信息较为完整和稳定，不收纳那些未经过验证 过的注释，在模式生物基因组方面较为突出，目前 收录了90个物种的基因组
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NCBI基因组浏览器
在线地址：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome
一个强大工具： Entrez检索系统 FTP下载地址：
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KEGG 富集分析
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可变剪切分析
• 可变剪切体定量 • 可变剪切类型定性
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可变剪切定量分析
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可变剪切类型定性分析
• 真核生物基因结构
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• 可变剪切
可变剪切定性统计
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基因融合分析
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SNP
• SNP：single nucleotide polymorphism,单核苷酸 多态性 • Indel：insert&deletion,插入缺失变异
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Other questions?
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基因定量表达实现方法
• 应用基因组比对得到的BAM以及下载的GFF/GTF文件进行转 录本重构及定量 cufflink –p cpu_cores –u –b genome.fa –G GFF/GTF –o 结果输出
BAM_file或者BAM1,BAM2,BAM3
• 如果为多个样本同时定量 cuffdiff –p cpu_cores –u –b genome.fa –G GFF/GTF -L name1,name2,name3 –o 结果输出 BAM1 BAM2 BAM3
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转录组分析
• 分析材料收集 • 分析流程概要 • 分析结果展示
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基因组比对区间统计
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基因组覆盖率统计
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基因饱和度分析
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测序偏向性分析
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基因表达分布统计
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样本相关性/重复性分析
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差异基因火山图分析
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组间差异韦恩图
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GO? Annotation
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Fastq 格式解析之Reads name
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Fastq 格式解析
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Fastq 格式解析
C SB
Fastq 格式解析
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Raw reads 质控标准
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数据展示
• 454
– Fna – Qual
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转录组分析
• 分析材料收集 • 分析流程概要 • 分析结果展示
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Mapping名词解释
• Mapping ratio：比对上基因组的reads占总reads的比例 • Unique mapping reads: 在基因组上只有一个位置匹配的 reads个数 • Multi mappint reads:在基因组上有多个位置匹配的reads 个数 • Pair mapping reads:成对mapping在基因组上的reads • Single mapping reads: 一对reads中只有一个mapping到基 因组 • Splicing mapping reads：位于剪切位点reads
• 随着多种生物genome的相继解码，使得annotation 的工作量和复杂度大大增加。大多数基因在不同 真核生物中拥有共同的主要生物功能，通过在某 些物种中获得的基因或者蛋白质的生物学信息， 可以用以解释其他物种中对应的基因或蛋白。 直系同源(orthology) , 旁系同源(paralogy) • Gene Ontology（简称GO）由上述的想法而诞生， 用来将所有的蛋白质功能进行分类
ftp://ftp.Baidu Nhomakorabeacbi.nlm.nih.gov/genomes/
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NCBI基因组浏览器
NCBI基因组在原核生物方面变现较为突出，几乎涵 盖了所有已经公布的原核生物基因组信息，将近 3000种原核生物
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其他基因组数据库
• http://www.phytozome.net/ 植物 • http://www.jgi.doe.gov/ 植物，真菌
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基因定量表达结果
基因标准化公式
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差异表达基因
• 采用DEG-SEQ分析包进行差异分析，采用fishertest精确检验统计学方法，FDR假阳性率修正算法 以及Fold-Change表达差异倍数进行差异基因分析 • 常规差异基因筛选标准：
– FDR< 0.05 – Fold-Change>=2
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Ensemble基因组浏览器
在线浏览查找地址： • http://asia.ensembl.org/index.html • http://plants.ensembl.org/index.html • 一个强大的工具：BioMart FTP下载地址:
ftp://ftp.ensembl.org/pub/ ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants
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GFF文件格式
GTF文件格式
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Ensemble基因组浏览器
在线浏览查找地址： • http://asia.ensembl.org/index.html • http://plants.ensembl.org/index.html
FTP下载地址:
ftp://ftp.ensembl.org/pub/ ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants
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SNP type
C SB
Gene fusion
C SB
SSR
• SSR-simple sequence repeat->mostly plant
– SSR标记(sequence tagged microsatellite site)，即STMS， 是目前最常用的微卫星标记之一，原理就是简单序列 重复长度多态性（SSLP），因为某一特定的微卫星的 侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，而且重复 单元在不同物种中也是特异性的
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BAM
基因组比对结果
• SAM文件：Sequence Alignment/Map Format • BAM文件：binary alignment/map format • 查看BAM文件： samtools view BAM_file | more
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基因定量表达
• Cufflinks：权威RNA-seq定量工具
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高通量测序技术相关知识
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测序技术发展
一代测序 二代测序 三代测序
……
Sanger测序 ABI 3730
Solexa 测序
Pac Bio单分子测序 Helicos单分子测序
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454 FLX测序 SOLID测序
……
Fastq 格式解析
由测序仪器得到的序列片段，称之为Reads，一堆Reads放在一起就是Fastq文件， 下面为Fastq文件解析
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比对基因组
• Tophat: RNA-SEQ权威比对工具 splicing比对算法：即分段比对算法，当某条测序序 列位于转录本剪切位点时，也就是这条序列同时属 于两个外显子，如果将它与参考基因组进行比对， 它将无法找到它合适的位置；但是应用分段比对算 法就可以将这条测序序列分割变成多段子序列，然 后应用这些段子序列与基因组进行比对，这样就可 以找到它们真正的位置
1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
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LncRNA分析
1. Transcript Length >= 200bp
2.
3.
Transcript ORF < 300bp
根据已知数据库conding和non-conding区域建立的氨基酸替换模型，蛋 白编码区域氨基酸非同义替换频率低，同义替换频率高，non-conding 区域反之。将1,2步得到transcripts进行多物种比对，通过分析序列多 物种比对结果以及替换频率规则评估transcripts序列属于conding和 non-conding的可能性，使用这种可能性比值区别conding与nonconding