组织学技术

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4.新鲜组织若需保存，应将所取组织用锡箔纸包好 放人液氮速冻，然后臵于-70℃冰箱中保存。 取材时防止人为因素的影响，刀剪应锋利，避免用 钝刀前后拉动组织或挤压组织。应避免使用有齿镊 夹取组织时动作轻柔，不宜过度用力，以免挫伤或 挤压组织，引起组织结构的变形组织块上如有血液 黏液、粪便等污物应用水冲洗干净再取材。
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（二）混合固定液 1.A-F液 （酒精-甲醛液）有固定兼脱水作用，固定后直 接入95%酒精脱水，配制方法 无水酒精或95%酒精（A） 90ml，40%甲醛（F）10ml，混合。适用于皮下组织中的 肥大细胞。 2.Bouin液 参透力强，对组织固定均匀，收缩很少，不 会使组织变硬变脆。特别使用于睾丸活组织的固定。小 块组织只需固定数小时，较大脏器固定12-24小时为宜 苦味酸饱和水溶液75ml，40%甲醛水溶液25ml，冰醋酸 5ml。也可用酒精混合配制：80%酒精150ml， 40%甲醛 60ml；冰醋酸15ml；结晶苦味酸1g，用前配制。该配方 的Bouin液比 Bouin液原液参透力更强，固定后可直接进 行95%酒精脱水。适用于淋巴结乳腺和脂肪组织。 3.Zenker液 是为光镜研究而设计的固定液中最好的一种
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优点：能较完好的保存酶类及各种抗原活性,尤其是对热或 有机溶剂耐受能力弱的酶及细胞表面抗原。不足之处在于冷 冻过程中组织细胞容易形成冰晶，影响细胞形态及抗原定位， 严重时甚至损伤细胞结构。通常可采取骤冷、速冻的方法加 以解决。组织速冻的方法很多，常用液氮法和干冰-丙酮法。 1.液氮法将组织块平放于瓶盖或标本盒等适当容器内， 缓慢放入盛有液氮的小杯（如保温杯）内，当组织块接触液 氮开始汽化沸腾后，使组织块保持原位，组织即由底部向表 面迅速冷冻形成冻块，取出后用铝箔包好，编号存入液氮灌 中或-70 ℃低温冰箱中，可保存数月或数年。如短期内用， 可保存于-30 ℃冰箱片组织包埋后，用切片机将蜡块切成薄片，这个 过程称为石蜡切片。由于石蜡包埋的组织块能长期保存，石 蜡切片操作简单，能切薄片，又能连续切片，可用于大批量 切片。是最常用的切片。切片机有轮转式切片机和平推式切 片机。切片厚度3-5um，组织切片直接进入40 ℃ 恒温热水 器中待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60 ℃ 烤片30-60min后即可进行染色。
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固定液 ：用于固定组织的 化学物质称固定液或固定 剂。分为单纯固定液和混 合固定液两种，由单一化 学物质组成者称单纯固定 液；由几种化学物质混合 组成者称混合固定液或复 合固定液。最常用的组织 固定剂是甲醛。乙醇溶液 也可做为固定剂。
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（一）单纯固定液 1.甲醛（fomeldehyde）40%市售甲醛水溶液，价格便宜，组 织穿透力强，固定均匀，组织收缩少，可长期保存标本： 适用多种染色，对脂类、神经及髓鞘均优良好的固定效果。 也可固定高尔基体、线粒体和糖类。 原理：甲醛是 一种交联性组织固定剂，主要通过使蛋白 质分子交链而产生固定作用。 配制方法：10ml甲醛+90ml蒸馏水 2.中性甲醛：是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液（PBS）为溶剂配 臵的甲醛溶液，浓度同前。固定效果及对组织抗原性的保 存均优于一般的甲醛溶液，是人体及实验动物组织最常用 的固定液。 3.酒精：具有硬化、固定、脱水作用，但组织渗透力较弱， 80%-95%浓度为好。酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白， 后者沉淀后能溶于水，所以用酒精作为固定剂不利于染色 体的固定，使核染色不良。50%以上酒精可溶解脂肪及类 脂、溶解血红蛋白损害其他色素不能用酒精固定。如证明 尿酸结晶和保存糖类，可用100%酒精固定。
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固定液的穿透力
穿透深度（ mm） 4h 8h 2.70 4.70 1.70 2.50 1.00 3.80 2.00 1.00 3.50 4.00 1.5 5.00 3.00 1.50 12h 5.00 5.00 5.00 1.75 5.00 3.5 1.75
10%中性福尔马林
95%乙醇 丙酮
1.22 %苦味酸饱和 水溶液
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二、细胞取材及制片 方法有印片法、穿刺法、沉淀法和活细胞标本的制备 1.印片法；常用于活检手术标本，优点是操作简单，细胞 抗原保存好。 2.穿刺法：淋巴结、软组织、肝、肾和肺等的穿刺标本， 穿刺液少时可以直接涂在载玻片上，穿刺液多或细胞丰富 时可先离心后涂片。 3.沉淀法：主要用于胸水、腹水、尿液和脑脊液等体液多 而细胞少的标本，一般需离心后将细胞悬液制成细胞涂片。 4.活细胞标本的制备；多用于科研标本主要来源于建株的 培养细胞、短期培养细胞和外周血。细胞可以直接培养在 盖玻片上，也可以培养于培养瓶或培养板内，制成细胞悬 液，收集细胞后再进行涂片。
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第二节 固定及常用固定剂
固定：将组织浸入某些化学试剂，使细胞内物质尽量保持 其生活状态时的形态结构和位臵，这一过程称为固定。 作用： 1.保持组织细胞与生活相似的结构形态。防止离体组 织自溶，和细菌繁殖导致的组织腐败。 2.保持定位细胞内特殊的成分，如细胞内的蛋白质经 过固定可沉淀或凝固定位在细胞内的原有部位。 3.便于区分细胞内原有的组织成分：固定可使组织细 胞中的各种成分沉淀凝固并易于着色，同时固定后组织细 胞内的不同物质可产生不同的折光率，对染料产生不同的 亲和力，因而经过染色后容易加以区别。 4.有利于切片：固定剂兼有组织硬化作用，能使细胞 从半液体状（胶体）变为半固体状（凝胶），因此，固定 后的组织硬度增加，易于切片。 5.保存抗原及DNA、RNA，特别准备用于做免疫组化染 色和核酸原位杂交的标本，及时而恰当的固定由为重要。
第五节 常用的组织学染色技术及其应用 为提高标本各部分在光学显微镜下的分辨率，达到有效地 观察组织细胞结构的目的，必须进行适当的染色。 一、苏木素-伊红染色 能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述 正常和病变组织的形态，而且HE切片可较常时间保存，因 而是生物学和医学领域（包括诊断、教学和科研）中最基 本，也是适应用最广泛的染色方法，被称为常规染色方法。
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二、冷冻切片 手术中的快速病理诊断、某些特殊染色（如显示脂滴的 苏丹Ⅲ染色、酶组织化学染色）及某些免疫组织化学染色或 核酸原位杂交。冷冻切片可用于新鲜组织、固定组织和低温 冰箱冷藏的组织块等，其方法主要有恒冷切片和半导体制冷 冷冻切片,切片方法为调节恒冷箱的温度至-20℃左右,将组 织直接臵与包埋托上,滴加OTC包埋剂或甲基纤维素,待其遇 冷固化后直接进行切片.冷冻切片的厚度6-8um,切出的切片 贴附于载玻片上,风干固定后进行染色.冷冻切片亦可用锡箔 纸包好后臵于冰箱中保存,一般在4 ℃可保存一周左右。-20 ℃可保存1-3个月,-70 ℃可保存6-12个月。
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影响固定的因素很多，如组 织与固定液的比例，固定时 间、固定的温度等。固定剂 本身有一定的影响，不恰当 的固定剂会引起细胞内物质 不同成度的损失，应注意几 点。1.根据研究目的不同选 择合适的固定液，如进行 Masson染色最好选择甲醛升 汞、Zenker、Bouin’s 液固定 。
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2.固定液要足量，至少要组织块总体积的10倍以 上，组织块取下后立即或尽快放入适当的固定液 中。适宜的固定：在保存细胞结构和抗原性之间 取得必要的平衡。不同的组织需要不同的固定液 才能达到满意的效果。 3.固定时间与固定液的种类、组织块的大小、固 定时的温度有关。一般情况下大多数组织的固定 时间3-24小时，然后存于70%的酒精中。常在室温 （25℃）固定。如低温（4 ℃）固定时，固定时 间应相应延长。全自动脱水机施加恒定的温度使 得在有限的时间内完成固定过程 （35℃）。
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第三节组织的脱水、透明、浸腊和包埋 脱水；用某些溶媒臵换组织内水份的过程。脱水剂必须能 与水任意比例混合，常用的脱水剂有酒精、丙酮及叔丁醇， 酒精及叔丁醇最常用。丙酮收缩作用强较少作为脱水剂应 用。 透明：脱水后必须经过即能与酒精相混合又能溶解石蜡的 溶剂，通过这种溶剂的媒介作用使石蜡浸入组织块。此过 程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变的透明 称之为透明。 组织染色后也要进行透明，最常用的透明剂为二甲苯，处 理时间30分钟。还有苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲 酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。无水乙醇和二甲苯混合 液30分钟，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ控制在1.5h内。 浸蜡；组织块经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程。用其 它透明剂（火棉胶、碳腊和明胶）浸入组织内部的过程称 为浸透或透入。为使石蜡充分浸入组织块中，3小时。换三 次腊。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56 ℃
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2.干冰-丙酮法 将组织块放进内盛有OTC包埋剂或甲基纤维 素糊状液的容器内，组织块完全浸没即可。将丙酮倒入盛有 10g干冰的保温杯调成糊状，将有组织块的标本盒放入保温 杯，待包埋剂成白色冻块时取出，如上法保存。 组织速冻时应注意：标本盒不能直接浸入液氮，以免组 织膨胀破碎；速冻的包埋剂应适量；新鲜组织不能放入 -10 ℃冰箱内缓慢冷却，否则组织内水分可逐渐析出形成冰 晶，造成组织结构破坏。
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c. 切片: 用切片机将组织切成1~20μm厚的蜡片，然后将其放 到温水上，待其完全展开后，裱到有粘附剂的载玻片上。 20
除切片外，还有其他处理组织的方法： * 铺片(Whole mount): 用于很薄的组织，如肠系膜。 * 磨片(Ground section): 用于很坚硬的组织，如骨和牙。 * 涂片(Smear): 用于液态组织，如血液，精液和唾液。 21
10%醋酸 7%升汞 2.5重铬酸钾
固定的方法： 1.浸泡 2.蒸气固定法：常用于固定组织中的可溶性物质 3.注射、灌固定法：用于某些组织快体积过大或 固定剂难以进入其内部的标本，或需要整个脏器 或动物进行固定时。 4.滴加法：多用于细胞涂片的固定。 5.微波固定法：固定的组织具有核膜清晰、染色 质均匀、组织结构收缩小等优点。应严格控制温 度（63 ℃ -65 ℃）。一般不主张微波固定小块 活检组织。
组织学技术
教学课件 王景霞
佳 木 斯 大 学 基础医 学 院组 织 胚 胎 学 教 研 室
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第一章 常规组织学技术
本章讲介绍常规的组织病理学技术包括组织（细胞）取 材、固定、包埋、切片、苏木精-伊红染色以及常规的特殊 染色方法。 第一节组织与细胞的取材 一、组织取材 组织标本主要取之于活检标本、手术切除标本、动物 模型标本以及尸体解剖标本。取材的原则。 1.组织的厚度为0.2-0.3cm；面积1-1.5cm，最多不超过2 cm， 太大太厚的组织块常常固定不好；对于冷冻切片取材组织 块可略厚（0.3-0.4cm）；用于免疫组织化学染色的组织块， 以1×1×0.2cm为好，不要太大，以免浪费试剂。 2.对于皮肤、腔道器官及囊壁组织应剪成细条。 3.骨组织需先经脱钙处理
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脑组织脱水透明时间
• • • • • • • • • • • 70%乙醇(24h) 80%乙醇(24h) 90%乙醇(12h) 95%Ⅰ乙醇(12) 95乙Ⅱ醇(12h) 100%Ⅰ乙醇(4h) 100%Ⅱ乙醇(4h) 二甲苯Ⅰ15min 二甲苯Ⅱ15min 浸蜡3-4h 包埋
包埋：组织块经过浸蜡和浸透用包埋剂包起的过程称包埋。 包埋后便制成含组织的块，使组织达到一定的硬度和韧度 有利于切成薄片。石蜡包埋最常用，石蜡熔点为60 ℃左右 酶染色时需采用低温石蜡包埋。采用52-56 ℃ 左右的石蜡 包埋。以保存组织内的酶活性。
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此液中的铬酸、冰醋酸和氧化贡均有组织固定作用。经 Zenker液固定的标本，胞核和胞质染色颇为清晰。一般 固定12-24即可。但配制该液的试剂较昂贵，且需处理 汞。 配制方法： Zenker 贮存液 重铬酸钾2.5g，升汞 5.0g，蒸馏水100ml，将升汞、重铬酸钾和蒸馏水混于 烧杯中，加热（40-50℃）溶解，冷却后过滤，贮存与 棕色瓶中。临用时取贮存液95ml，加入冰醋酸5ml，即 为Zenker液。固定时间12-16h，流水冲洗12h。 4.Carnoy 穿透能力强，能很好的固定胞浆和染色质， 特别适合外膜致密的组织，同时溶解大部分脂肪。适用 于糖原和尼氏体的固定，对显示DNA和RNA的效果很好。 小块组织块1-2h即可。 配制方法：无水酒精60ml，冰醋酸10ml，氯仿30ml。适 用于DNA、RNA的固定。