动物细胞培养实验讲义

———————动物细胞培养 实验讲义——————— 实验一动物细胞培养的培养基配制灭菌与仪器操作培训

一、实验目的

1、掌握动物细胞培养相关设备、器材的使用方法。

2、掌握各类器皿、工具的清洗、包装、灭菌方法

3、掌握各类培养基及试剂溶液的配制、灭菌方法

二、实验原理

离体条件下的细胞对任何有害物质均十分敏感，极少的残留物都可能对细胞产生毒副作用，因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，以达到不含任何残留物的要求。而玻璃、橡胶、塑料、布类、纸类等不同类型的材料应采用不同的清洗和消毒、灭菌方法。

细胞培养失败的一个常见原因是微生物污染，有时是操作过中不规范造成的，有时则是相关用品本身有污染造成的，因此在培养细胞前各种用品均需要进行严格消毒或灭菌。

培养液是进行细胞体外培养最基本、最主要的条件之一，掌握常见培养液的成分、性质与配制方法是细胞培养操作者应具有的基本知识和能力。

三、实验内容

1、设备

（1）CO2培养箱

CO2培养箱要提前消毒，有些自己带有高温干热灭菌功能，大部分则宜用“纯水擦洗――95%酒精擦洗——紫外照射杀菌”的消毒方法。

初次开启仪器时要提前一天矫正CO2的浓度值。然后设定好温度等参数。

关于钢瓶的压力阀门控制：钢瓶上的阀门松紧程度不是十分重要，关键靠供气阀门控制压力在0.1（越拧紧压力越高，所以可先把供气阀门打到松弛状态，然后再开钢瓶阀门）（2）倒置显微镜

打开电源开关，确保光路杆调至“观察”状态，选择所需放大倍数的物镜，调节至适当亮度。将培养瓶放在载物台上，转动粗微调调节。如需拍照，则在电脑中打开软件，并将光路杆调至“拍照”状态。

注意不要随便误打开荧光灯，以免浪费其寿命。一旦打开荧光光源后，至少要15分钟后才能关闭，关闭后至少要5分钟才能再次开启。

（3）其他：高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱等。

2、器具

（1）玻璃类

细胞培养瓶（有的是塑料的）、吸管、三角烧瓶、玻璃平皿、普通玻璃瓶

方法：玻璃类一般是清水浸泡、洗衣粉液刷洗、浸酸过夜、自来水冲洗、然后依次用去离子水、一蒸水、三蒸水分别润洗5～6次。然后烘干、包扎、灭菌。

（2）塑料类

细胞培养瓶、细胞培养板等

方法：一般是一次性用品，拆包后直接使用；如果要重复使用则参照玻璃器皿的方法，最后照射紫外线消毒。

（3）金属类

剪刀、镊子、灭菌筒等

方法：清洗后用纸包扎，高压灭菌。

（3）其他

纱布、脱脂棉、酒精棉、棉绳、牛皮纸、铝箔、一次性手套、乳胶手套等

方法：主要是用于包扎灭菌上述器具等，一般不存在自身如何灭菌的问题。

3、试剂

（1）基础培养液（如1640、MEM、DMEM、199等）

干粉溶于约800ml超纯水（三蒸水），袋子内面也冲洗收集进去，搅拌助溶（不宜加热）按说明书，再补加NaHCO3(2g)、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。

用1M HCl或1M NaOH调PH至7.1

定容至1L，过滤除菌（蔡氏滤器抽滤）

（2）完全培养基

基础培养基临用前加入小牛血清（10%－20%）。（注：新买血清要先56℃灭能半小时，以杀灭其中的补体物质，消除对细胞的毒性。然后分装，－70℃～－20℃低温冻存）

加抗生素，双抗终浓度一般为青霉素100U/ml、链霉素100U/ml。（传统市售青霉素80万U/瓶，可溶于4ml体积；市售链霉素为100万U/瓶，可溶于5ml体积；用时每L

培养液各加0.5ml。另：青霉素钠1670U/mg,链霉素碱 1000U／mg,硫酸链霉素798U／mg）（3）0.25%胰蛋白酶

称取250mg胰蛋白酶干粉于无菌烧杯中，先用灭菌的D－Hanks（即不含Ca2+、Mg2+和葡萄糖）液调成糊状，然后补足至100ml，搅拌混匀，在磁力搅拌器搅拌至溶解（室温和4℃交替进行）

过滤除菌，分装入青霉素小瓶，低温冻存。

使用前可用无菌7.4% NaHCO3调PH至7.2左右。

（4）洗涤液、平衡盐溶液（Hanks、D-Hanks等）

Hanks液成分:

Na2HP04 H20 0.06 g/L

K H2P04 0.06 g/L

MgSO4 7H200.20 g/L

葡萄糖 1.00 g/L

NaCl 8.00 g/L

CaCl2 0.14 g/L

① 先单独溶解CaCl2于100ml超纯水（或三蒸水）；

② 再单独溶解MgSO4 7H20于100ml超纯水；

③ 再单独溶解其他成分于650ml超纯水(按表中顺序,每次待前一成分充分溶解再加下一种成分)；

④ 将①液和②液缓慢倒入③液中，并不时搅动，防止沉淀。

⑤ 将0.35g NaHCO3溶解于37℃ 100ml超纯水

⑥ 用数滴NaHCO3液溶解0.02g酚红

⑦ 将⑤、⑥液逐滴并搅拌加入④液

⑧ 将⑦液移入容量瓶，定容至1L，混匀。

⑨ 高压灭菌（8磅10min），4℃保存。

四、总结与讨论

1、写出自己所在的小组准备出的全部用品，并说明其处理方法。

2、写出实验室的CO2培养箱和倒置显微镜的型号和操作要领。

3、Hanks液的配制中，为什么钙盐和镁盐需单独溶解？

4、胰酶消化液为什么最好用不含Ca2+、Mg2+的BBS配制？

实验二鸡胚原代细胞的培养

一、实验目的

1、掌握鸡胚组织的取材、剪切、消化技术

2、掌握细胞计数技术

3、掌握原代动物细胞制备过程

4、为细胞传代、冻存等后续实验操作提供材料

二、实验原理

发育中的鸡胚含有大量处于活跃分裂和生长过程的细胞，尤其是其中大量的成纤维细胞，是进行细胞培养良好的取材来源。

动物组织用中均含有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰蛋白酶消化法能去除间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞则容易生长。

三、实验用品

1、器材

超净台（或生物安全柜）、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养瓶、小玻璃瓶（青霉素小瓶）、不锈钢灭菌筒、100目不锈钢网筛（1个）、灭菌吸管、解剖剪（中号1把；小型眼科剪1把）、镊子（中号镊子2把，弯头眼科镊1把）、吸耳球、计数板、手动计数器、酒精棉、灭菌的平皿（3个）、无菌离心管（10ml规格，2只）。

2、试剂

Hanks液（或D- Hanks液）、DMEM（须含10-20%血清）、0.25%胰蛋白酶

3、材料

9-12日龄鸡胚（即鸡胚预先在培养箱中37℃培养9-12日，大头朝上，每天翻蛋至少2次，用水盘保证湿度）

四、实验步骤

（需提前准备：鸡胚提前9天孵化、开启CO2培养箱、器材用品包扎灭菌并烘干、培养液从冰箱中取出并融化、超净台提前开紫外灯半个小时进行消毒、37℃恒温水浴准备好）

1、取材

取9-12d的鸡胚2个，放入超净台中，大头（气室）朝上放置于蛋托上，酒精棉消毒气室部位。

用镊子敲破和剥去气室部位外壳，换一把镊子挑破尿囊膜和羊膜，再换一把镊子小心取出鸡胚，放于无菌平皿中。

用小剪刀和小镊子配合，去除头和内脏，用Hanks液清洗2-3次，用吸管洗弃清洗液，以洗去红细胞。

2、剪碎

将胚体移入另一无菌平皿中，用Hanks液清洗3次去除血污，切成小块，然后移入无菌青霉素小瓶中，在小瓶内用眼科剪反复剪成1mm3的小块。

3、消化

加入适量0.25%胰蛋白酶液（一般每10个鸡胚加20ml消化液），盖好橡皮塞，置37℃恒温水浴中消化20-30min，每隔5min摇动1次，使组织块散开。视组织块变得疏松、颜色略变白时，从水浴中取出。

4、终止

在超净台中，用吸管轻轻吸弃消化液，加入2-3ml含小牛血清的培养液，以终止消化。然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成单细胞状态，静置片刻，使未能消化的大块组织自然下沉，然后将上层液通过100目不锈钢网筛，制备细胞悬液。转移入无菌离心管。