DNA文库的构建和目的基因
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部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染
宿主细胞； ⑤重组克隆的挑选和保存。
基因组DNA文库
基因组DNA
限制性内切酶
基因重组
体外包装
转化细菌
三、原核生物基因组DNA文库的构建
（一）原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA
要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂
2)cDNA文库 (cDNA library) ：
• 是指将某种生物体基因组转录的全部 mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与 克隆载体重组，储存于某种受体菌中， 该群体就称该生物基因组的cDNA文库。
• cDNA(complementary DNA，互补 DNA)：是由生物的某一特定器官或特定 发育时期细胞内的mRNA经体外反转录 后形成的互补DNA。
（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞
１、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5: 与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互
补。
HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效
率高
２、重组质粒转化受体细胞
1）转化法(transformation):指将质粒DNA或 以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过 程。 2）转导法(transduction):指病毒及其重组子 导入受体细胞的过程. 3）转染法(transfection):指噬菌体及其重组 子导入受体细胞的过程.
• 又称DNA文库，是指某个生物的基因组 DNA或cDNA片段与适当的载体在体外 重组后，转化宿主细胞，并通过一定的 选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或 噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为 该生物的基因文库。
• 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主 组成。
2 构建基因文库的基本程序
• 1)提取研究对象基因组DNA，制备合适 大小的DNA片段，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成cDNA；
第一节 基因组DNA文库的构建
一、基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、
人工染色体文库（细菌人工染色体文库、 酵母人工染色体文库）。
二、基因组DNA文库构建的程序
①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的
提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的
？
真核生物基因组文库的构建与原核 生物基因组文库的构建有何不同
第二节 cDNA文库构建
真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和 mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳 分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染 色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。
方法：从平板上挑选单个克隆子接种 于合适的含抗生素的培养基中，菌体 生长到一定浓度后，加入终浓度为 25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保 存。
2、基因组文库的筛选
• 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛 选
• 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原 位杂交筛选
• PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩 增特异性片段
（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克Fra Baidu bibliotek单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
（三）酶切片段与克隆载体连接
• 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理 的载体连接形成重组DNA；
• 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后 侵染受体菌；
• 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
目的基因：
已知基因： 未知基因：构建基因文库
特定探针的制备 文库的筛选（筛库）
含目的基因的克隆
3 基因文库的分类
按照外源DNA片段的来源：
• 从特定组织提取的染色体基因组DNA---基因
组DNA文库 • mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定
基因文库
1)基因组文库 (Genomic library) ：
是指将某种生物体的全部基因组DNA用限 制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化 相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群 体就称为该生物基因组文库。其目 的是分离有 用的目的基因 和保存某种生物的全部基因。
（五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选
1、基因组DNA文库的保存
1) 影印膜滤保存法
2）文库在液体培养基中扩增保存
方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克 隆子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为25%的甘油）。
3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中
为了解决这个难题，一种可行的方法 就是将这个基因扩增，增加成功分离目 的基因的可能性。但是由于要分离的目 的基因往往是未知基因，因此无法对它 进行特异性扩增，而只能对所有的基因 进行扩增，也就是构建该生物材料的基 因文库，然后再根据不同的方法将所需 的克隆筛选出来，最后分离得到目的基 因。
1 基因文库(gene library)概念
１、酶切片段的分离与纯化 １）透析袋电洗脱法 ２）试剂盒回收目的片段
2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择
a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效 的范围为<10kb) b）载体可承载25kb DNA左右片段(有效的 范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有 效的范围为<40 kb)
第六讲 DNA文库的构建和 目的基因的筛选
§1 基因组DNA文库的构建 §2 cDNA文库的构建 §3 基因克隆的筛选策略
• 外源基因：插入到载体内的那个特定 的片段基因。
• 目的基因：那些已被或者准备要分离、 改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
宿主细胞； ⑤重组克隆的挑选和保存。
基因组DNA文库
基因组DNA
限制性内切酶
基因重组
体外包装
转化细菌
三、原核生物基因组DNA文库的构建
（一）原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA
要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂
2)cDNA文库 (cDNA library) ：
• 是指将某种生物体基因组转录的全部 mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与 克隆载体重组，储存于某种受体菌中， 该群体就称该生物基因组的cDNA文库。
• cDNA(complementary DNA，互补 DNA)：是由生物的某一特定器官或特定 发育时期细胞内的mRNA经体外反转录 后形成的互补DNA。
（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞
１、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5: 与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互
补。
HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效
率高
２、重组质粒转化受体细胞
1）转化法(transformation):指将质粒DNA或 以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过 程。 2）转导法(transduction):指病毒及其重组子 导入受体细胞的过程. 3）转染法(transfection):指噬菌体及其重组 子导入受体细胞的过程.
• 又称DNA文库，是指某个生物的基因组 DNA或cDNA片段与适当的载体在体外 重组后，转化宿主细胞，并通过一定的 选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或 噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为 该生物的基因文库。
• 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主 组成。
2 构建基因文库的基本程序
• 1)提取研究对象基因组DNA，制备合适 大小的DNA片段，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成cDNA；
第一节 基因组DNA文库的构建
一、基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、
人工染色体文库（细菌人工染色体文库、 酵母人工染色体文库）。
二、基因组DNA文库构建的程序
①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的
提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的
？
真核生物基因组文库的构建与原核 生物基因组文库的构建有何不同
第二节 cDNA文库构建
真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和 mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳 分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染 色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。
方法：从平板上挑选单个克隆子接种 于合适的含抗生素的培养基中，菌体 生长到一定浓度后，加入终浓度为 25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保 存。
2、基因组文库的筛选
• 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛 选
• 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原 位杂交筛选
• PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩 增特异性片段
（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克Fra Baidu bibliotek单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
（三）酶切片段与克隆载体连接
• 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理 的载体连接形成重组DNA；
• 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后 侵染受体菌；
• 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
目的基因：
已知基因： 未知基因：构建基因文库
特定探针的制备 文库的筛选（筛库）
含目的基因的克隆
3 基因文库的分类
按照外源DNA片段的来源：
• 从特定组织提取的染色体基因组DNA---基因
组DNA文库 • mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定
基因文库
1)基因组文库 (Genomic library) ：
是指将某种生物体的全部基因组DNA用限 制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化 相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群 体就称为该生物基因组文库。其目 的是分离有 用的目的基因 和保存某种生物的全部基因。
（五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选
1、基因组DNA文库的保存
1) 影印膜滤保存法
2）文库在液体培养基中扩增保存
方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克 隆子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为25%的甘油）。
3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中
为了解决这个难题，一种可行的方法 就是将这个基因扩增，增加成功分离目 的基因的可能性。但是由于要分离的目 的基因往往是未知基因，因此无法对它 进行特异性扩增，而只能对所有的基因 进行扩增，也就是构建该生物材料的基 因文库，然后再根据不同的方法将所需 的克隆筛选出来，最后分离得到目的基 因。
1 基因文库(gene library)概念
１、酶切片段的分离与纯化 １）透析袋电洗脱法 ２）试剂盒回收目的片段
2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择
a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效 的范围为<10kb) b）载体可承载25kb DNA左右片段(有效的 范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有 效的范围为<40 kb)
第六讲 DNA文库的构建和 目的基因的筛选
§1 基因组DNA文库的构建 §2 cDNA文库的构建 §3 基因克隆的筛选策略
• 外源基因：插入到载体内的那个特定 的片段基因。
• 目的基因：那些已被或者准备要分离、 改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。