DNA文库的构建和目的基因

（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
（三）酶切• 外源基因：插入到载体内的那个特定 的片段基因。
• 目的基因：那些已被或者准备要分离、 改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 ，其复杂程度是蛋白质和 mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳 分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染 色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。
• 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理 的载体连接形成重组DNA；
• 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后 侵染受体菌；
• 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。
目的基因）第一节 基因组DNA的构建
一、基因组DNA的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒序
①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的
提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的2)cDNA (cDNA library) ：
• 是指将某种生物体基因组转录的全部 mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与 克隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补 DNA)：是由生物的某一特定器官或特定 发育时期细胞内的mRNA经体外反转录 后形成A的保存1) 影印膜滤保存法
2）在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克 隆子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为25%的甘油）。
3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中
为了解决这个难题，一种可行的方法 就是将这个基因扩增，增加成功分离目 的基因的可能性。但是由于要分离的目 的基因往往是未知基因，因此无法对它 进行特异性扩增，而只能对所有的基因出来，部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染
宿主细胞； ⑤重
基因重组
体外包装
的提取 染色体DNA 质粒DNA
要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂
１、酶切片段的分离与纯化 １）透析袋电洗脱法 ２）试剂盒回收目的片段
2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择
a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效 的范围为<10kb) b）载体可承载25kb DNA左右片段(有效的 范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有 效的范围为<40 kb)
（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞
１、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5: 与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互
补。
HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效
率高
２、重组质粒转化受体细胞
1）转化法(transformation):指将质粒DNA或 以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过 程。 2）转导法(transduction):指病毒及其重组子 导入受体细胞的过程. 3）转染法(transfection):指噬菌体及其重组 子导入受体细胞的过程.
• 从特定组织提取的染色酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因1)基因组 (Genomic library) ：
是指将某种生物体的全部基因组DNA用限 制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化 相应的宿主细胞获得的所某片段与适当的载体在体外 重组后，转化宿主细胞，并通过一定的 选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或 噬菌体)，因组DNA，制备合适 大小的DNA片段，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成cDNA；
方法：从平板上挑选单个克隆子接种 于合适的含抗生素的培养基中，菌体 生长到一定浓度后，加入终浓度为 25%的甘油，于-70 oC或肽等作为抗原进行原 位杂交筛选
• PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩 增特异性片段