聚丙烯酰胺降解菌的分离鉴定及其降解特性

ｗａｓ晌ｍ ２５４５℃．ｉｎｉｔｉａｌ
ｈａｐｐｅｎｅｄ
ｉｎ ｔｈｅ ＰＡＭ
ＰＡＭ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｗａｓ ｆｒｏｍ ２００ ｔｏ ７００
ｍｇ・Ｌ’１＿孙ｅ
ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
５００ ｍｇ・Ｌ一，ｐＨ ９．０ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３０。Ｃ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ
１．２．２．２聚丙烯酰胺优势降解菌１６Ｓ ｒＲＮＡ序列测定
ｍｇ・Ｌ－１的ＰＡＮ溶液的粘度损失达１９．６％１９１。夏
彦渊等从油田污水中分离出７株对聚丙烯酰胺的降 解有显著效果的细菌，在以原油为基础培养基碳 源，以ＮＩ－ＬＨ：ＰＯ。为基础培养基氮源，在最佳条件下 ７株混合菌对聚丙烯酰胺粘度降解率可达３２．６％ｔｌｏｌ。 张英筠等在被聚丙烯酰胺污染的水样和土壤筛选 出生长良好菌种３株，优势菌在高浓度的ＰＡＭ溶 液中最适合的生长浓度为ｌ
浓度。刀。
１．２．２．５优势降解菌的降解特性
采用单因素试验法，设定不同的初始聚丙烯
万方数据
．２６．
东北农业大学学报
第４４卷
酰胺浓度、ｐＨ、温度，来研究其对降解率与底物 ｐＨ的影响，以确定降解菌降解的最佳培养条件。 ２
结果与分析
通过ＰＡＭ为唯一氮源的平板胁迫培养法筛选
２．１聚丙烯酰胺优势降解菌的筛选与鉴定 分离出１株耐受ＰＡＭ能力强、降解率高的细菌， 命名为ＰＡＭＢ３。
ｍｇ，蒸馏水１
０００ ｍＬ。
富集培养基：牛肉膏３ ｇ，蛋白胨１０
５
ｇ，蒸馏水１
１．２方法 １．２．１聚丙烯酰胺优势降解菌的筛选与分离
采用平板胁迫驯化法筛选出聚丙烯酰胺优势降 解菌”２１，并采用乎板法分离纯化菌株，保存备用。
１．２．２聚丙烯酰胺优势降解茵的鉴定
１．２．２．１聚丙烯酰胺优势降解菌的形态及生理生化特征
ｏｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，
ＰＡＭ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｏｆ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｐＨ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｆｎＤｍ ６．０ １０ １ １．０．ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
２．１．１
ＰＡＭＢ３的培养特征和形态特征 通过牛肉膏固体培养基培养３ ｄ观察，ＰＡＭＢ３
图２
Ｆｉｇ．２
ＰＡＭＢ３的系统发育树
Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ
ＰＡＭＢ３
单菌落为圆点状，表面凸起略有褶皱，白色，不 透明，营养琼脂上有可溶性色素（见图１）。 该菌扫描电镜放大５ ０００倍显示为短杆菌、产 芽孢、无鞭毛，菌体大小为（０．３８～０．４５）ｍｍｘ
ａｓ
ｗｈｉｃｈ
ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｗａｓ
ｐｒｏｄｕｃｅｄ．Ｎａｍｅｄ ＰＡＭＢ３．ＰＡＭＢ３ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｇｒｏｗ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｔｈｅ ｓｏｌｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｓｏｕｒｃｅｓ．Ｗｉｔｈ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ
ｏｎ
ｏｉｌ ｆｉｅｌｄｓ．Ｕｎｄｅｒ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ。
ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ＰＡＭ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｓ ｖｅｒｙ ｓｌｏｗ．Ｔｈｅ ｂｉｏ－ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｈａｒｍｌｅｓｓ ｗａｙ ｔｏ ｄｅａｌ ｗｉｔｈ
ＰＡＭ．Ｔｈｉｓ ｔｅｓｔ ａｄｏｐｔｅｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ １ ６Ｓ
ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅ ＰＡＭＢ３ ｗａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｓｔｉｌｉｓ．Ｔｈｉｓ ｔｅｓｔ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ
ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ
ａ
ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔａｂｌｅｔ ｓｔｒｅｓｓｉｎｇ
ｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ
ｓｃｒｅｅｎｅｄ
ＯＵｔ仃ｏｍ ｔｈｅ ｓｏｌｌ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔａｋｅｎ仃０ｍ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｌａｎｔ ｉｎ
李淑芹，韦微，包龙，等．聚丙烯酰胺降解菌的分离鉴定及其降解特性【Ｊ】．东北农业大学学报。２０１ ３，“（５）：２４－２８．
ＬＩ Ｓｈｕｑｉｎ，ＷＥＩ Ｗｅｉ。ＢＡＯ Ｌｏｎｇ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｃｒｙｉａｍｉｄｅ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ—ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｇｒａｄａ－
１ ０００
１
材料与方法
茵源样：大庆炼化聚合物二厂厂区土样。 基础培养液：蔗糖３０
ｇ，Ｋ：ＨＰＯ。・３Ｈ：０ １．６ ｇ，
１．１材料
ＫＨ２Ｐ０４・３Ｈ２０ ０．４ ｇ，ＭｇＳＯ・・７Ｈｚ０ ０．０６ ｇ，ＮａＣｌ Ｏ．５
ｇ，Ｆｅ２（Ｓ０４）３
ＺｎＳＯ，０．０５
０．０３ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．０１ ｇ，ＣｕＳ０４ Ｏ．０５ ｍｇ， ０００ ｍＬ。 ｇ，ＮａＣｌ
ＰＡＭＢ３的降解曲线 ＰＡＭＢ３
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ
（Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １ ５００３０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＰＡＭ）ｊｓ
ａｎ
ａｄｄｉｔｉｖｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ
本试验参照文献［１３—１４１中菌株的常规鉴定方 法，对聚丙烯酰胺优势降解菌进行鉴定：①观察 菌株在牛肉膏固体培养基上的培养特征；②进行 革兰氏染色；③在显微镜及扫描电镜下观察菌株 的形态特征ｎ４，；④进行葡萄糖发酵、氧化酶、过 氧化氢酶、甲基红、淀粉水解、产氨、硝酸盐还 原、产吲哚、硫化氢、明胶液化、Ｖ—Ｐ试验等生理 生化试验。
归属。
１．２．２．３菌悬液的制备和ＯＤ值的测定
ｍｇ・Ｌ－１，并
ｍｇ・Ｌ．１的ＰＡＭ溶液有良好降解效果，此 菌种还可以对丙烯酰胺高效降解，使降解过程不 出水中筛选出１株ＰＡＭ降解细菌，在温度为
３５℃、ｐＨ为７．５的条件下，５００ ｍｇ・Ｌ＿１ ＰＡＭ溶液降
会对环境造成二次污染ｎ”。包木太等从胜利油田采
对１０
０００ ０００～１０ ０００
降解菌１６Ｓ ｒＲＮＡ序列测定由上海生工生物工 程技术服务有限公司完成。采用１６Ｓ ｒＲＮＡ序列测 定法对菌株ＤＮＡ进行提取、扩增及序列测定。所得 测序结果通过ＢＬＡＳＴ程序与ＧｅｎＢａｎｋ中核酸数据进 行序列搜索比对后，选择亲缘关系较近的菌株作为 参比菌株，用ＭＥＧＡ４．０软件构建系统发育树。 结合菌株形态分析、生理生化特征和１６Ｓ ｒＲＮＡ序列测定及系统发育分析，初步鉴定菌株的
聚丙烯酰胺降解茵的分离鉴定及其降解特性
李淑芹，韦 微，包
龙，许景钢
（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨１５咖３０）
摘
要：聚丙烯酰胺（ＰＡＭ）是一种油田采油添加剂，在自然条件下自发降解缓慢，生物降解是ＰＡＭ无害化处
理的新途径。采用平板胁迫法从聚丙烯酰胺生产厂区土壤中分离得到聚丙烯酰胺降解细茵１株，命名为ＰＡＭＢ３。 以聚丙烯酰胺为唯一氮源进行生长。通过形态特征、生理生化特征及１６ＳｒＲＮＡ序列分析，确定其为枯草芽孢杆菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。同时分别考查底物浓度、反应温度、初始ｐＨ值等条件对ＰＡＭ降解效果影响。结果表明， ＰＡＭＢ３降解聚丙烯酰胺的适宜奈件为ｐＨ ６－１１、温度２５—４０℃、初始聚丙烯酰胺浓度２００～７００ ｍｇ－Ｌ－１。在舍５００ ｍｇ・Ｌ－１聚丙烯酰胺、ｐＨ为９的基础培养液中，３０ ｏｃ条件下，培养７ ｄ降解率达４５．０４％。 关键词：聚丙烯酰腠；生物降解；鉴定；芽孢杆菌 中图分类号：￥７６７．５；Ｘ１７２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００５—９３６９（２０１３）０５—００２４－０５
４０
冰
３０
料 整 逝
∞葛－口ｏ＝∞智∞文∞ｏ
２０
１０
图１
Ｆｉｇ．１
ＰＡＭＢ３的扫描电镜图片（×５伽０） ＳＥＭ Ｉｍａｇｅ ｏｆ ＰＡＭＢ３（ｘ５０００）
Ｏ
培养时间（ｄ） ２．１．２
ＰＡＭＢ３的生理生化特征 革兰氏染色及生理生化实验表明，降解菌
图３
Ｆｉｇ．３ Ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ
万方数据
第５期
李淑芹等：聚丙烯酰胺降解菌的分离鉴定及其降解特性
聚丙烯酰胺（ＰＡＭ）是一种线型水溶性高分子 聚合物，是丙烯酰胺均聚物和共聚物统称，可溶 于水，具絮凝性、增稠性、耐剪切性、降阻性、 分散性等性能“Ｊ。被广泛应用在石油开采、水处 理、纺织、造纸、选矿、医药、农业等领域口一１。 但是，ＰＡＭ在为油田生产提高采收率同时，对地 面工程产生恶劣影响ｐ】。 注入地层的ＰＡＭ随原油厂水混合液进入地面油 水分离与水处理终端，大幅度提高混合液粘度和 乳化性，使油水分离难度加大，造成采出水含油 量严重超标。部分含较高浓度ＰＡＭ采出水外排， 使ＰＡＭ进入地下油层，很难避免其渗透到地下水 层。ＰＡＭ在地面水体和地下水中长期滞留，不仅 会改变水的理化性质，ＰＡＭ本身会产生一部分化 学需氧量ＣＯＤ，也会对当地水环境造成严重污染川， 释放伤害人和动物周围神经系统丙烯酰胺ｍＩ。因 此，寻找一种高效降解ＰＡＭ的方法是ＰＡＭ使用者 和环境保护者的研究课题。 近年来，随着微生物技术发展，微生物修复 技术成为降解ＰＡＭ使其无害化重要手段陋１。ＰＡＭ生 物降解菌筛选成为本领域研究热点盯叫。黄峰等从 中原油田取样的污水中培养出的硫酸盐还原菌， 可在聚合物驱油中生长繁殖并使ＰＡＭ发生降解，
解率最高可达到３８．４％，降解后不会对环境产生二
次污染［Ｓｌ。
１
根据参考文献【１５】制备菌悬液，０Ｄ。为 ０００，４。Ｃ下保存备用。 采用淀粉一碘化镉分光光度法测定聚丙烯酰胺
１．２．２．４聚丙烯酰胺浓度的测定
本试验从聚丙烯酰胺生产厂区土壤中分离鉴 定出１株降解聚丙烯酰胺的细菌。研究该菌株的降 解能力及其适应条件，旨为聚丙烯酰胺生物修复 提供菌株资源和科学依据。
第４４卷第５期 ２０１３年５月 网络出版时间２０１３—５～２９
１５：５９：５９
东北农监大学学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
４４（５）：２４—２８
Ｍａｙ ２０１３
【ＵＲＬ］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｌ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２３．１３９１，Ｓ．２０１３０５２９．１５５９．００５，ｈｔｍｌ
ＰＡＭＢ３‘Ｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４５。Ｑ４％ｆｏｒ ７ ｄ。
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ；ｂｉｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
收稿日期：２０１２－０７－３０ 基金项目：黑龙江省留学回国基金项目（ＬＣ０４Ｃ１９）：哈尔滨市科技攻关项目（２０１０ＡＡ４ＣＳ０２４） 作者简介：李淑芹（１９６２一），女，博上，教授，博士生导师，研究方向为环境污染生物修复。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｕｑｉｎｌｉ００７＠１２６－ｃｏｍ
ｔｉｏｎ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１ ３，４４（５）：２４・２８．（ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｌｉｓｈ ａｂｓｔｒａｃｔ）
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ——ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ／ｕ Ｓｈｕｑｉｎ，ＷＥＩ Ｗｅｉ，ＢＡＯ Ｌｏｎｇ，ＸＵ Ｊｉｎｇｇａｎｇ
（１．７３。１．９７）ｍｍ。
２．２降解菌ＰＡＭＢ３的降解特性
２．２．１
降解菌ＰＡＭＢ３对ＰＡＭ的降解曲线
无菌条件下，将２％的菌悬液加入含５００ ｍｇ・Ｌ－１ 聚丙烯酰胺的基础培养液中，３次重复，置于空气 浴摇床（３０
果见图３。
５０
ｏＣ，１２０
ｒ・ｒａｉｎ‘１）进行培养，每天取样测
定培养基ｐＨ和聚丙烯酰胺的降解率变化情况，结