【CN110029081A】过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及其构建方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910301370.1

(22)申请日 2019.04.15

(71)申请人 厦门大学

地址 361005 福建省厦门市思明南路422号

(72)发明人 何宁　王玲伟　

(74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所

(普通合伙) 35200

代理人 马应森

(51)Int.Cl.

C12N 1/21(2006.01)

C12N 15/75(2006.01)

C12P 19/04(2006.01)

C12R 1/10(2006.01)

(54)发明名称

过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因

子基因的工程菌及其构建方法

(57)摘要

过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因

子基因的工程菌及其构建方法。过表达碳分解代

谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN利用PCR扩

增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，核苷酸序列如

SEQ ID No1。利用PCR扩增克隆碳分解代谢物阻

遏效应转录抑制因子基因ccpN，将基因ccpN片段

连接到表达载体上，导入地衣芽孢杆菌中，通过

四环素抗性筛选获得目的基因的工程菌。构建方

法：设计PCR引物；将目的基因插入到PHY300PLK -

PamyL -TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位

点，得过表达质粒，导入到E.coli DH5α中扩增；

将过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，筛选转化

子，

验证得地衣芽孢杆菌重组菌。

权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图1页CN 110029081 A 2019.07.19

C N 110029081

A

权　利　要　求　书1/1页CN 110029081 A

1.过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN，其特征在于利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，ccpN基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2.一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于利用PCR扩增克隆碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN，将基因ccpN片段连接到表达载体上，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中，通过四环素抗性筛选获得目的基因的工程菌。

3.如权利要求2所述一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体为游离载体。

4.如权利要求2所述一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体为表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL。

5.如权利要求2所述一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。

6.如权利要求5所述一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。

7.如权利要求2所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的PCR引物；

2)将扩增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点，得到PHY300－ccpN过表达质粒；

3)将PHY300－ccpN过表达质粒导入到E.coli DH5α中扩增；

4)将经提取、浓缩后的PHY300－ccpN过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h，于四环素抗性LB固体培养基上涂布，在37℃培养12h，筛选转化子；

5)转化子经质粒提取后，通过菌落PCR和双酶切进行验证，获得过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-6。

8.如权利要求2所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中应用的具体步骤如下：

1)使用接种环于四环素抗性培养基上取一环地衣芽孢杆菌重组菌HN301-6单菌落接种于液体种子培养基中，35～37℃，200r/min培养12～16h，制备种子培养液；

2)以体积百分比为4％的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，在30～40℃，150～300r/min条件下培养50～60h，进行发酵产多糖絮凝剂实验；

3)将多糖絮凝剂发酵后所得发酵液离心收集上清液，将上清液用乙醇沉淀法沉淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于在步骤3)中，所述乙醇沉淀法的具体步骤为用三倍体积的乙醇提取，4℃静置12h，离心的速度为6000rpm，离心时间为15min，离心温度为4℃。

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