中华鳖细菌疫苗免疫佐剂的筛选及其初步应用
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收 稿 日期 ： ０ ８—１ ２０ ２—１ ０
４株温 和气 单 胞 菌 Ｔ ９ １１ （ 离 自患 典 型 Ｋ ６００ 分 肠 出血性 败血症 病 甲鱼 ） Ｌ ７４４ （ 离 自患穿 、Ｔ ９０２ 分 孔 病 甲鱼 ） Ｋ ７４ ９ （ 、Ｔ ９０ ０ 分离 自患 红脖 子红 底 板病
甲鱼） Ｌ７ ５８ （ 、Ｔ ９ ０２ 分离 自 患腐皮病 甲鱼） 由浙江 省 淡水水 产研究 所 鱼病 实验 室保 存 。
鳖和对照组 的 １ 中华鳖血液并制备血清 ，用浙江省淡水水产研究所制备的针对 中华 鳖 ＩＭ 的单抗 ３－ 只 ｇ １ １ ３介
导的 Ｅ ＩＡ方法 ，测定血清 中的抗体效价 。结果表 明 ：当 中华鳖 免疫后 ４ ，血 清 中抗 体效价达到最 高 ， ＬＳ ０ｄ 为 １ ６４×１ ： ． ０ ；免疫后 ５ 将 受免中华 鳖分成 ４组 ，分别用 ４种菌株 以 ５ Ｄｏ （ ０ｄ Ｌ ５ ９×１ ｂ ｍ ）进行 攻毒 ０ ＂／ Ｌ 试验 （ ． Ｌ 只 ） ０ ５ｍ ／ ，结果免疫保护率均达到 １０ ，而对照组死亡率均 为 １０ ０％ ０ ％。
子红底板 病、鳖腐皮病 的 ４株病原菌 ，在体积分数 为 ３ ５ ． ％的福尔 马林 溶液 中灭活 ２ 。在灭 活的 ４株菌 ４ｈ
中添加不 同佐 剂 ，充分混匀后分别制备成总含菌 量为 ６Ｘ１’ ｍＬ的 ４价菌苗 ，分别 免疫 ８只 ＩＲ小 鼠， － ０ ￣／ Ｃ 并设不加佐剂免疫 组及空 白组作为对照 。经 ３次免疫后 ，随机选 ３只小 鼠抽血 制备血清 ，用 间接 Ｅ ＩＡ方 ＬＳ 法测定抗 体效 价 ，除空 白对照组外 ，其它 ４组小鼠的免疫血清效 价为 １ ． ：１６×１ 一１ ２ ５ ０ ： ．６×１ ０ ，各 免疫 组的效价依次为弗 氏佐剂 ＞白油佐剂 ＞蜂胶佐剂 ＞不加佐剂 。另外 ５只小 鼠用于免 疫保 护性试验 。结果表 明 ：３种佐剂 的免疫保护率 均为 １０ ，而不加佐 剂组 免疫 保护率为 ８ ％ ，空 白对照组死亡率为 １０ 。考 ０％ ０ ０％ 虑到弗氏佐剂 的成本较高且 白油佐剂有副作用 ，故选择蜂 胶作为免疫佐剂 ，制备 了中华 鳖 ４价菌苗。用该 菌苗免疫接种 ５ ０只体重为 １０～１０ｇ 只 的健康 中华鳖 ，注射剂 量为 ０ ２ｍ ／ ，并 设置对 照组 （ ０ ５ ／ ， ． Ｌ 只 注射等 量的生理盐水） ，共接种 ２ ０只健康 中华鳖 。分别 于免疫后第 ２ 、３ 、４ 、５ Ｏ Ｏ Ｊ ０天随机采集 ３只受免疫的 中华 Ｄ
挑选 ４ 株对鳖危害性较大 的温和气单胞菌制备菌 苗 ，并选择 ３ 种不同佐剂进行免疫 ，筛选合适的免 疫佐 剂 ，旨在 为进一 步开发 研制 鳖用疫 苗 ，有 效地
防治 鳖 的病害提供 参 考依据 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 菌株 来源 ．
株的出现，而且污染环境 ，导致鳖肉质量下降等 ， 而采用免疫预防可避免这些弊端 。国外商品性鱼用 疫苗 在 ２ ０世纪 ７ Ｏ年代 已开始 生 产 ，国 内对 鱼用 疫 苗也 有研 究 】 ，但 对 于鳖病免 疫 的研究 不 多 。贾 亚东 等 【 比较 了嗜水气 单胞 菌等 ３种致 病 菌 的粗 脂 ６ 多糖 （ Ｐ ）对 中华鳖的免疫原性 ，结果表 明，在 ＬＳ ３ 种供试菌的粗脂多糖中不同程度地存在 ３ 种致病 菌的共同保护性抗原。杨先乐等 引 卜 报道 了中华鳖 对 菌苗抗原 的免疫应答 ，探讨 了中华鳖的免疫 应答 规律 。本 研 究 中 ，作者 以小 白 鼠为试 验 动 物 ，
中华 鳖细 菌疫 苗免 疫 佐 剂 的 筛选及 其 初 步应 用
郝贵杰 ，潘 晓艺，姚嘉赞 ，徐洋 ，尹文林 ，沈锦 玉
（ 浙江省淡水水产研究所 ，浙江 湖州 ３３０ ） １０１
摘要： 将分离自中华鳖 Ｔ ｏ ｘ ｉｎｉ主要细菌性疾病——肠道出血性败血症、鳖穿孔病 （ ｒｎ ｎ ｓ ｉ ｙ ｓｅ ｓ 疖疮病） 、红脖
１ ２ 方法 ．
１２ １ 细茵培养 ．．
在普通营养 肉汤培养基 中加入
葡 萄糖 、无机 离子 成为 改 良营养 肉汤 培养基 。将细
基金项 目： 浙江重大科技攻关项 目 （２ ０ Ｃ ２ ０ ） ０ ４ １０ ７ 作者简介 ： 郝贵杰 （９ ９ ，女 ， １７ 一） 助理研究员。Ｅ— ａ ：ｍ ｌｓ １ ＠ｓ ａｅｍ ｍ ｉ ｅｓ ５ １ ｉ ．ｏ ｌ ｉａ ｎ 通信作者 ：沈锦玉 （９ ３一） １６ ，女 ，研究员。Ｅ—ｍａ ：ｓｉｙ＠１６ ｔｎ ｉ ｊ ｕ ２ ． ｏｉ ｌ ｎ
关键 词 ： 中华鳖 ； 细菌疫苗； 佐剂；免疫预防； 单克隆抗体
中图分类 号 ：￥４． ９７ １
文献标 志码 ： Ａ
近 年来 ，在 中华 鳖 Ｔｉ ｙ ｉ ｎｉ ｒ ｎｘｓ ｅｓ ｏ ｎ ｓ的养 殖 生 产 中 ，鳖 的 疾 病 越 来 越 多 ，因 而 造 成 巨大 的 经 济 损 失 … 。 目前 ，引起 中 华 鳖 的 主要 细 菌 性 疾 病 有 肠 道 出血性 败血 症 、鳖 穿孔 病 （ 疮 病 ） 疖 、红 脖 子 红 底板 病 、鳖腐 皮 病 等 。沈 锦 玉 等 已从 这 些 患 病 鳖上 分离 到温 和气单 胞菌 Ａｒｍ ｎｓｓｂａ ｅｏ ｏａ ｏｒ 。采用 药 ｉ 物 防治这 些病 其效果 不甚理 想 ，还易造 成抗 药性 菌
大 连 水 产 学 院 菌分别 接种 在普通 营养 肉汤及 改 良营养 肉汤培养基
第２ ５卷第 １ 期 ２０１０ 年 ２月
大 连
水 产
学 院 学 报
Ｖｏ． ５ Ｎｏ １ １２ ． Ｆ ｂ．２０ｌ０ ｅ
wk.baidu.com
Ｊ ＯＵＲ ＮＡＬ ＯＦ ＤＡＵ ＡＮ ｎ Ｓ ＲＩ Ｓ ＵＮ Ｖ Ｓ Ｔ ＨＥ Ｅ Ｉ ＥＲ Ｉ Ｙ
文章 编号 ：０ ０—９ ５ （ ００ｌｌ一 ０ ９— ５ １０ ９７ ２１ ０ ０１ ０
４株温 和气 单 胞 菌 Ｔ ９ １１ （ 离 自患 典 型 Ｋ ６００ 分 肠 出血性 败血症 病 甲鱼 ） Ｌ ７４４ （ 离 自患穿 、Ｔ ９０２ 分 孔 病 甲鱼 ） Ｋ ７４ ９ （ 、Ｔ ９０ ０ 分离 自患 红脖 子红 底 板病
甲鱼） Ｌ７ ５８ （ 、Ｔ ９ ０２ 分离 自 患腐皮病 甲鱼） 由浙江 省 淡水水 产研究 所 鱼病 实验 室保 存 。
鳖和对照组 的 １ 中华鳖血液并制备血清 ，用浙江省淡水水产研究所制备的针对 中华 鳖 ＩＭ 的单抗 ３－ 只 ｇ １ １ ３介
导的 Ｅ ＩＡ方法 ，测定血清 中的抗体效价 。结果表 明 ：当 中华鳖 免疫后 ４ ，血 清 中抗 体效价达到最 高 ， ＬＳ ０ｄ 为 １ ６４×１ ： ． ０ ；免疫后 ５ 将 受免中华 鳖分成 ４组 ，分别用 ４种菌株 以 ５ Ｄｏ （ ０ｄ Ｌ ５ ９×１ ｂ ｍ ）进行 攻毒 ０ ＂／ Ｌ 试验 （ ． Ｌ 只 ） ０ ５ｍ ／ ，结果免疫保护率均达到 １０ ，而对照组死亡率均 为 １０ ０％ ０ ％。
子红底板 病、鳖腐皮病 的 ４株病原菌 ，在体积分数 为 ３ ５ ． ％的福尔 马林 溶液 中灭活 ２ 。在灭 活的 ４株菌 ４ｈ
中添加不 同佐 剂 ，充分混匀后分别制备成总含菌 量为 ６Ｘ１’ ｍＬ的 ４价菌苗 ，分别 免疫 ８只 ＩＲ小 鼠， － ０ ￣／ Ｃ 并设不加佐剂免疫 组及空 白组作为对照 。经 ３次免疫后 ，随机选 ３只小 鼠抽血 制备血清 ，用 间接 Ｅ ＩＡ方 ＬＳ 法测定抗 体效 价 ，除空 白对照组外 ，其它 ４组小鼠的免疫血清效 价为 １ ． ：１６×１ 一１ ２ ５ ０ ： ．６×１ ０ ，各 免疫 组的效价依次为弗 氏佐剂 ＞白油佐剂 ＞蜂胶佐剂 ＞不加佐剂 。另外 ５只小 鼠用于免 疫保 护性试验 。结果表 明 ：３种佐剂 的免疫保护率 均为 １０ ，而不加佐 剂组 免疫 保护率为 ８ ％ ，空 白对照组死亡率为 １０ 。考 ０％ ０ ０％ 虑到弗氏佐剂 的成本较高且 白油佐剂有副作用 ，故选择蜂 胶作为免疫佐剂 ，制备 了中华 鳖 ４价菌苗。用该 菌苗免疫接种 ５ ０只体重为 １０～１０ｇ 只 的健康 中华鳖 ，注射剂 量为 ０ ２ｍ ／ ，并 设置对 照组 （ ０ ５ ／ ， ． Ｌ 只 注射等 量的生理盐水） ，共接种 ２ ０只健康 中华鳖 。分别 于免疫后第 ２ 、３ 、４ 、５ Ｏ Ｏ Ｊ ０天随机采集 ３只受免疫的 中华 Ｄ
挑选 ４ 株对鳖危害性较大 的温和气单胞菌制备菌 苗 ，并选择 ３ 种不同佐剂进行免疫 ，筛选合适的免 疫佐 剂 ，旨在 为进一 步开发 研制 鳖用疫 苗 ，有 效地
防治 鳖 的病害提供 参 考依据 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 菌株 来源 ．
株的出现，而且污染环境 ，导致鳖肉质量下降等 ， 而采用免疫预防可避免这些弊端 。国外商品性鱼用 疫苗 在 ２ ０世纪 ７ Ｏ年代 已开始 生 产 ，国 内对 鱼用 疫 苗也 有研 究 】 ，但 对 于鳖病免 疫 的研究 不 多 。贾 亚东 等 【 比较 了嗜水气 单胞 菌等 ３种致 病 菌 的粗 脂 ６ 多糖 （ Ｐ ）对 中华鳖的免疫原性 ，结果表 明，在 ＬＳ ３ 种供试菌的粗脂多糖中不同程度地存在 ３ 种致病 菌的共同保护性抗原。杨先乐等 引 卜 报道 了中华鳖 对 菌苗抗原 的免疫应答 ，探讨 了中华鳖的免疫 应答 规律 。本 研 究 中 ，作者 以小 白 鼠为试 验 动 物 ，
中华 鳖细 菌疫 苗免 疫 佐 剂 的 筛选及 其 初 步应 用
郝贵杰 ，潘 晓艺，姚嘉赞 ，徐洋 ，尹文林 ，沈锦 玉
（ 浙江省淡水水产研究所 ，浙江 湖州 ３３０ ） １０１
摘要： 将分离自中华鳖 Ｔ ｏ ｘ ｉｎｉ主要细菌性疾病——肠道出血性败血症、鳖穿孔病 （ ｒｎ ｎ ｓ ｉ ｙ ｓｅ ｓ 疖疮病） 、红脖
１ ２ 方法 ．
１２ １ 细茵培养 ．．
在普通营养 肉汤培养基 中加入
葡 萄糖 、无机 离子 成为 改 良营养 肉汤 培养基 。将细
基金项 目： 浙江重大科技攻关项 目 （２ ０ Ｃ ２ ０ ） ０ ４ １０ ７ 作者简介 ： 郝贵杰 （９ ９ ，女 ， １７ 一） 助理研究员。Ｅ— ａ ：ｍ ｌｓ １ ＠ｓ ａｅｍ ｍ ｉ ｅｓ ５ １ ｉ ．ｏ ｌ ｉａ ｎ 通信作者 ：沈锦玉 （９ ３一） １６ ，女 ，研究员。Ｅ—ｍａ ：ｓｉｙ＠１６ ｔｎ ｉ ｊ ｕ ２ ． ｏｉ ｌ ｎ
关键 词 ： 中华鳖 ； 细菌疫苗； 佐剂；免疫预防； 单克隆抗体
中图分类 号 ：￥４． ９７ １
文献标 志码 ： Ａ
近 年来 ，在 中华 鳖 Ｔｉ ｙ ｉ ｎｉ ｒ ｎｘｓ ｅｓ ｏ ｎ ｓ的养 殖 生 产 中 ，鳖 的 疾 病 越 来 越 多 ，因 而 造 成 巨大 的 经 济 损 失 … 。 目前 ，引起 中 华 鳖 的 主要 细 菌 性 疾 病 有 肠 道 出血性 败血 症 、鳖 穿孔 病 （ 疮 病 ） 疖 、红 脖 子 红 底板 病 、鳖腐 皮 病 等 。沈 锦 玉 等 已从 这 些 患 病 鳖上 分离 到温 和气单 胞菌 Ａｒｍ ｎｓｓｂａ ｅｏ ｏａ ｏｒ 。采用 药 ｉ 物 防治这 些病 其效果 不甚理 想 ，还易造 成抗 药性 菌
大 连 水 产 学 院 菌分别 接种 在普通 营养 肉汤及 改 良营养 肉汤培养基
第２ ５卷第 １ 期 ２０１０ 年 ２月
大 连
水 产
学 院 学 报
Ｖｏ． ５ Ｎｏ １ １２ ． Ｆ ｂ．２０ｌ０ ｅ
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Ｊ ＯＵＲ ＮＡＬ ＯＦ ＤＡＵ ＡＮ ｎ Ｓ ＲＩ Ｓ ＵＮ Ｖ Ｓ Ｔ ＨＥ Ｅ Ｉ ＥＲ Ｉ Ｙ
文章 编号 ：０ ０—９ ５ （ ００ｌｌ一 ０ ９— ５ １０ ９７ ２１ ０ ０１ ０