发酵工程课件第五章

（四）湿热灭菌

原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且 在高温有水分条件下，蛋白质易变性。 常用方法：
水煮常压灭菌：100℃ 饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30min


使用范围：培养基和发酵设备灭菌。
（五）过滤除菌

原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。
方法: 0.01~0.45 m孔径滤膜， 使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他 不耐热化合物溶液除菌。
2. 空气过滤除菌的介质
用于空气过滤的过滤介质有：
（1）纸类过滤介质 （3）微孔滤膜类过滤介质 （2）纤维状或颗粒状过滤介质
3. 过滤器的结构
（1）深层棉花（活性炭、玻璃纤维）过滤器 深层棉花过滤器是立式圆筒形，内部充填过滤介质， 空气由下向上通过过滤介质，以达到除菌的目的。
填充物按下列顺序安装：



3. 介质过滤除菌法

过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质，以阻截 空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。 通过过滤除菌处理的空气可达到无菌，并有足够 的压力和适宜的温度以供好氧培养过程之用。 该法广泛应用，是获得大量无菌空气的常规方法， 在生产中使用最多。


按过滤机 制的不同
绝对过滤 利用微孔滤膜，其孔隙 小于0.5甚至0.1μm，将空气中的细菌滤除， 从而获得无菌空气。
第五章 发酵工程的灭菌 与空气除菌
第一节 常用的灭菌方法与原理 第二节 培养基灭菌工艺 第三节 空气除菌
第一节 常用的灭菌方法与原理

灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备 中所有生命物质的技术或工艺过程。
一 常见的灭菌方法 （一）化学物质灭菌 原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋 变性酶失活。 白质
*
（二） 辐射灭菌

原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸 的光化学反应造成菌体死亡。 常用：紫外线、X射线和γ射线。 使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌


（三） 干热灭菌

原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变 性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌
使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环 境灭菌， 不能用于培养基灭菌
常用的灭菌剂
化学物质名称 新洁尔灭(苯扎溴铵) 杜灭芬 高锰酸钾 漂白粉 酒精 煤酚皂（来苏尔） 有效浓度 0.25% 0.25% 0.1%-0.25% 5% 75% 1%—5% 化学物质名称 甲醛 戊二醛 苯酚 过氧乙酸 焦碳酸二乙酯 有效浓度 37% 2% 0.1%-0.15% 0.02%-0.2% 0.01%-0.1%
1
0.1 0.01
118℃ 115℃
105℃
0.001
110℃ 121℃
A：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) △E：杀死细菌所需的活 化能（J/ mol）
0.0001 0 5 10 15 20 25
Ó ±¼ ¨ © ¼ È Ê ä £ min£
二、培养基灭菌工艺

（一）培养基灭菌时间的选择
2. 静电除菌

近年来一些工厂已使用静电除尘除去空气中的水雾、油雾、 尘埃，同时也除去了空气中的微生物。 静电除菌时是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌 的目的。 悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷，没 有带电荷的微粒进入高压静电场时都会被电离成带电颗粒。 对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引 力等于或小于微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被 吸附而沉降，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低。


二 、 湿热灭菌原理
（一）生物热死动力学（对数残存定律） dN / dt =- K N
N：菌体个数（个） t : 灭菌时间（min） k：反应速度常数（min-1） dN / dt: 菌受热死亡速率(个/min)
（二）反应速率常数K
如何通过实验根据对数残存定律确定某一 温度,某一微生物的K ？ 1. K 与菌种的特性有关
深层介质过滤 由多种介质组成过滤 层，滤层较深，空隙较大，靠静电、扩散、 惯性和阻截作用等将细菌截留在滤层中，从 而获得无菌空气。
二、空气的深层过滤除菌原理和介质
1. 空气的过滤除菌原理
① 布朗扩散截留作用 ② 拦截截留作用 ③ 惯性撞击截留作用 ④ 重力沉降作用 ⑤ 静电吸引作用
1. 空气的过滤除菌原理
在过滤除菌中，有时很难分辨上述各种机理各自所作贡献的大小。 随着参数的变化，各种作用之间有着复杂的关系，目前还未能作准 确的理论计算。 一般认为惯性撞击截留、拦截截留和布朗运动截留的作用较大，而 重力和静电引力的作用则很小。
气流速度小：布朗 扩散截留和拦截截 留显著 气流速度大：惯性 撞击截留作用显著
缺点 1． 投资费用高 2． 对物料要求高 3． 蒸汽用量大
四、培养基灭菌方法选择原则
1． 培养基成份（易降解成分、液化情况等） 2． 设备状况（冷却面积、传动装置等） 3. 动力条件
五、高温对培养基成分的有害影响及其防止
六、消除高温有害影响的措施


采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）
对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液 与其他成分分别灭菌后再合并； 对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌， 然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；
-dC/dt = K’ C Ln (C/ C0 ) = - K ' t
-dC/dt :营养物降解速度 mol / L h C: 营养物浓度 mol / L K’ : 营养物降解反应速 度常数 1 / s t ：时间( S )
A’：比例常数 R：气体常数(J/ mol K) T：绝对温度( K) E’：营养物破坏所需的活化能 （J/ mol）
相同温度下，微生物越耐热， k值越小； 相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。
2. K 与灭菌温度有关
È ¬ ¾ ¿ ß Ë ú ¿ ß Ä À ú ß Ê È Ö ·Ñ æ ¸ ¾ Ñ æ µ È Ë Ç Ï
N/N 0
K=A e （阿累尼乌斯方程） Ln K =Ln A- E/ RT
–E / RT
一 空气净化的方法
各种不同的培养过程，鉴于其所用菌种的生长能力强弱、 生长速率的快慢、培养周期的长短以及培养基中pH值差异， 对空气灭菌的要求也不相同。所以，对空气灭菌的要求应 根据具体情况而定。 一般可按10－3的染菌概率，即在1000次培养过程中，只 允许一次是由于空气灭菌不彻底而造成染菌，致使培养过 程失败。 空气净化的方法大致有以下几种：
孔板——铁丝网——麻布——棉花— —麻布——活性炭——麻布——棉 花——麻布——铁丝网——孔板
1. 2. 3.
热灭菌法 静电除菌 介质过滤除菌法
1. 热灭菌法
基于加热后微生物体内的蛋白质（酶）热变性而得以实现。 它与培养基的加热灭菌相比，虽都是加热法把微生物杀死， 但两者的本质是有区别的。
鉴于空气在进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力，所 以，空气热灭菌时所需的温度，就不必用蒸汽或其他载热体加热，而可直 接利用空气压缩时的温度升高来实现。 空气经压缩后温度可升到200℃以上，保持一定时间后，便可实现干热 杀菌。 利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气具有 特别重要的意义。 在实际应用时，对培养装置与空气压缩机的相对位置，连接压缩机与培 养装置的管道灭菌以及管道长度等问题都必须加以仔细考虑。
空气灭菌的必要性
好氧微生物在培养过程中，其生长、繁殖、代谢均需 要大量氧气的参与； 所需氧气通常是以空气的形式提供的； 空气中含大量的各类微生物，如果随空气一同进入培 养系统，便会在合适的条件下大量繁殖，与目的菌株竞 争性消耗营养物质，并产生各种副产物，从而干扰或破 坏纯种培养过程的正常进行，甚至使培养过程彻底失败 导致倒罐； 因此空气的灭菌是好氧培养过程中的一个重要环节。
枯草芽孢杆菌
金黄色小球菌 酵母菌 病毒 霉状分枝杆菌
0.5～1.1
0.5～1.0 3.0～5.0 0.0015～0.225 0.6～1.6
1.6～4.8
0.5～1.0 5.0～19.0 0.0015～0.28 1.6～13.6
空气中微生物的数量 与环境有密切关系。 一般干燥寒冷的 北方，空气中含微生 物量较少，而湿润温 暖的南方空气中含微 生物较多； 城市空气中的微生 物含量（103-104个 /m3）比人口稀少的 农村多； 地平面空气中微生 物含量比高空多。
（一）定义： 将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽 加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭 菌方式。

（二）操作过程：
空罐准备：清洗、检修和检测。 升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。
保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。
冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。
温度随灭菌时间的变化
（三）发酵罐分批灭菌示意图
t =1/ k * Ln( N0/ N) 其中 K：一般耐热的细菌芽孢的K值 N0 ：细菌及芽孢数之和 N：10 -3
（二）培养基灭菌温度的选择
选择即能达到灭菌要求， 又保证营养成分不被破坏的温度

1.培养基营养成分破 坏动力学方程 K’ = A’ e- E’/ RT Ln K’ =Ln A’- E’/ RT
维持数分钟
三、 连续灭菌与分批灭菌的比较与选择
分批灭菌 优点： 1．不需附加设备 2． 蒸汽利用率高 3． 节约劳动力 连续灭菌 优点： 1 采用高温快速灭菌法 2．可以把培养基按其性质分开灭菌 3． 有利于自动控制 4． 节省冷却水
缺点 1． 培养基质量比较差 2． 罐的利用率低 3. 冷却水用量大
2. 根据实验结果灭菌活化能大于培养基破坏活化能 E＞ E’ 3. 当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解 速度常数变化得大 4. 达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t 越短，采 用高温短时（HTST）灭菌效果好

（ 三） 影响灭菌效果的因素

微生物种类：不同的微生物k值不同。 初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的 对数成正比。 培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。 传热与混合状况：影响受热均匀度。 培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。 蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。

pH：酸性pH下可加快微生物热死速率。
第二节 培养基灭菌工艺
一、分批灭菌(batch sterilization) 二、连续灭菌(continuous sterilization)
一 分批灭菌方法（实验室种子培养基）
手提式灭菌锅结构示意图
立式
台式
卧式

一 分批灭菌(batch sterilization)


对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组 合培养基）可进行低压灭菌。
wk.baidu.com 第三节 空气除菌
一 二 三 四 空气净化的方法 空气的过滤除菌原理和介质 空气净化的流程 附属设备
氧气 气态物质的混合物 氮气 惰性气体 二氧化碳 空气（即大气） 水蒸气 悬浮在空气中的灰尘 烟灰
构成地壳的无机物质颗粒 植物花粉 种类繁多的细菌和其他微生物
空气中常见微生物种类及大小 微生物 产气杆菌 蜡状芽孢杆菌 普通变形杆菌 地衣芽孢杆菌 巨大芽孢杆菌 蕈状芽孢杆菌 宽/μm 1.0～1.5 1.3～2.0 0.5～1.0 0.5～0.7 0.9～2.1 0.6～1.6 长/μm 1.0～2.5 8.1～25.8 1.0～3.0 1.8～3.3 2.0～10.0 1.6～13.6
三路进汽：直接蒸汽 从通风、取样和出料 口进入罐内直接加热， 直到所规定的温度， 并维持一定的时间。 这就是所谓的“三路 进气”。
*
四路出汽：直接蒸汽 从排气、接种、进料 和消沫剂管排气
二、连续灭菌(continuous sterilization)

定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续 流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方 式。

流程： （一）由热交换器组成的灭菌系统 （二）蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统
（三）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统
由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图
温度随时间的变化
蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统
温度随灭菌时间的变化
连消塔——喷淋冷却连续灭菌流程
40-50℃ 132℃ 预热至60-70 ℃