免疫细胞功能检测技术

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二、巨噬细胞功能检测
(一)炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%
炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据
此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，
细胞大小(直径μm) 12～20
12～16
核大小、染色质 增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
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有或无
未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
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2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物：
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一、T细胞功能的检测
➢T细胞增殖试验 ➢T细胞分泌功能测定 ➢T细胞介导的细胞毒试验 ➢体内试验
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（一）T淋巴细胞增殖试验
1. 原理：
淋巴细胞
刺激物
DNA合成
母细胞
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分化
细胞变大
细胞浆扩大 空泡 核仁明显
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核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞 过渡型
PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞 特异性刺激物：
异种抗原
同种组织抗原
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3. 检测方法
形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h）
DNA合成期 + 3HTdR掺入
抗IgM 细菌脂多糖 SAC的SPA
B细胞增殖
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形态学
3H－TdR掺入 法
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(二) 溶血空斑试验
1. 原理：
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2. 方法学：
➢ 经典溶血空斑形成试验 ➢ 被动溶血空斑试验
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3．临床应用与评价
➢溶血空斑试验主要用于测定药物和 手术等因素对体液免疫功能的影响
➢评价免疫治疗或免疫重建后机体产 生抗体的能力。
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2. 溶菌法
杀菌 (% （ 1 率 )作 3、 用 6 0或 0 9m 0菌 in 落 ） 10 数 0 0m菌 in 落数
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3．NBT还原试 验
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
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N-NH2 C N=NH
甲臜（紫黑色）
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中性粒细胞 NBT 甲臜颗粒沉积于胞质中
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(3) MTT 比色法
培养 液
PHA
3H-MTTdTR
淋巴细胞
全
血
离
心
分层 液
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过滤
测 量测 放射性吸光度
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(二) T细胞分泌功能测定
体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激
后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生
物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、
生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功
免疫细胞功能检测技术
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一 淋巴细胞的功能检测
淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外
实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对
抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体
外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂
原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴
细胞分泌产物的测定
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淋巴细胞
➢T细胞（负责细胞免疫功能） ➢B细胞（执行体液免疫功能） ➢NK细胞（非特异性免疫作用）
收集细胞
检测β射线
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测定细胞内的3H－TdR 8
（1）形态学检查法
转化率
转化的淋巴细胞数 10% 0
转化和未转化的胞淋数巴细
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方法学评价：
➢优点：形态学方法简便易行，普通光 学显微镜便能观察结果，适于基层实验 室应用。 ➢缺点：是依靠肉眼观察形态学变化， 判断结果易受主观因素影响，重复性和 准确性较差。
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(四) 体内试验
➢体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、 破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 ➢将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫 前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血 清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判 断受检者体内B细胞的功能。
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三、NK细胞活性测定
➢形态法 ➢酶释法 ➢荧光法 ➢同位素法 ➢化学发光法
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(三) B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法ELISPOT
1.原理：
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2．应用与方法学评价：
➢该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检
测抗体分泌量。
➢优点：
稳定、特异、抗原用量少；
可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定
量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
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染色计数 靶 离心取上清 细 测LDH或AKP 胞 离心取沉淀 溶 测活细胞荧光 解
测Cห้องสมุดไป่ตู้M值
测发光强度
常用靶细胞: K562细胞株
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二 吞噬细胞功能检测技术
按其形态大小分为两类： 大吞噬细胞—单核-吞噬细胞系统 小吞噬细胞—中性粒细胞
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一、中性粒细胞功能的检测
➢ 细胞趋化功能的检测 ➢ 吞噬和杀菌功能的检测
靶细胞 51Cr
效应细胞
测量上清液中 释放的51Cr
洗 涤
去除游离
的51Cr
混合培养4-6小时
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(四) 体内试验
➢特异性抗原皮肤试验 ➢PHA皮肤试验
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二、B细胞功能检测
➢B细胞增殖能力的试验 ➢溶血空斑试验 ➢B细胞抗体形成功能的检测 ➢体内试验
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(一)B细胞增殖能力的试验
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(一) 细胞运动功能——趋化功能检测
1.原理：
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2. 方法： 滤膜渗透法（Boyden 小室法）
琼脂糖平板法
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(二)吞噬和杀菌功能测定 1．显微镜检查法：
吞噬率 (%)
吞噬细菌的白细胞数 100
计数的白细胞数
杀菌率 (%)
胞内含着染菌体数 的细胞 100
计数的白细胞数
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（2）3H-TdR掺入法
培养 液 PHA
3H-TdR
淋巴细胞
全
血
离
心
分层 液
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过滤
测 量 放 射 性
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试验孔A均值
SI对照
570nm
孔A均值
570nm
➢优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观
性强，重复性好。
➢缺点：但需一定设备条件，同时还存在
放射性核素污染问题。
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能。
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（三）T细胞介导的细胞毒试验
1.原理：
靶细胞抗原
T细胞 靶细胞
致敏CTL
精选p观pt 察杀伤活力
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2.方法
➢形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残 留肿瘤细胞
意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力
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图15-精2选pTp细t 胞细胞毒试验示意图
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51Cr释放法