香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用的制作方法

本技术公开了樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用，属于林业分子生物学技术领域。

本技术筛选了11对香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，将其应用在古樟遗传多样性分析和古樟谱系分析中，基于叶绿体单倍型分析显示，不同单倍型分布差异明显，大部分单倍型只存在于特定的群体中，只有少数单倍型为共享单倍型，表明单倍型间存在一定的地理分化。

18个古樟群体的遗传分化系数Fst为0.212，基因流Nm为0.929，表明古樟群体间存在中等的基因流。

本技术的SNP分子标记重复性好，能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。

权利要求书
1.香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，其特征在于，包括11对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：
CpSNP1上游引物如SEQ ID NO.1所示；
CpSNP1下游引物如SEQ ID NO.2所示；
CpSNP2上游引物如SEQ ID NO.3所示；
CpSNP2下游引物如SEQ ID NO.4所示；CpSNP9上游引物如SEQ ID NO.5所示；CpSNP9下游引物如SEQ ID NO.6所示；CpSNP13上游引物如SEQ ID NO.7所示；CpSNP13下游引物如SEQ ID NO.8所示；CpSNP14上游引物如SEQ ID NO.9所示；CpSNP14下游引物如SEQ ID NO.10所示；CpSNP15上游引物如SEQ ID NO.11所示；CpSNP15下游引物如SEQ ID NO.12所示；CpSNP16上游引物如SEQ ID NO.13所示；CpSNP16下游引物如SEQ ID NO.14所示；CpSNP18上游引物如SEQ ID NO.15所示；CpSNP18下游引物如SEQ ID NO.16所示；CpSNP19上游引物如SEQ ID NO.17所示；CpSNP19下游引物如SEQ ID NO.18所示；
CpSNP20上游引物如SEQ ID NO.19所示；
CpSNP20下游引物如SEQ ID NO.20所示；
CpSNP21上游引物如SEQ ID NO.21所示；
CpSNP21下游引物如SEQ ID NO.22所示。

2.根据权利要求1所述的香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，其特征在于，所述多态性引物的PCR-HRM扩增体系为：上下游引物各10μM，1μL；2×Froget-Me-Not EvaGreenqPCR Master Mix 5μL，H2O 2μL，DNA模板30ng，1μL，所述体系的总体积为10μL。

3.根据根据权利要求1所述的香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，其特征在于，所述多态性引物的PCR-HRM扩增程序为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，30-35个循环；
95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

4.权利要求1所述的香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟遗传多样性分析中的应用。

5.权利要求1所述的香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟谱系分析中的应用。

6.权利要求4或5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取不同品种香樟的基因组DNA；
2)用权利要求1SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示的引物对步骤1)提取的基因组DNA进行PCR 扩增和HRM分析；
3)数据分析叶绿体SNP位点多态性，古樟谱系分析，古樟遗传多样性分析。

技术说明书
香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用
技术领域
本技术属于林业分子生物学技术领域，具体涉及香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用。

背景技术
香樟(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)是樟科樟属高大乔木，具有重要的生态、文化和经济价值，是我国重要的材用和特种经济树种。

近年来有关香樟分类学、生理学、化学成分与利用、良种选育和营林技术等方面的研究己有较多报道，但对其种质资源遗传多样性的研究却很不充分。

香樟在我国具有较早的栽培历史，地区间引种栽培情频繁，其延续至今，针
对群体遗传分析的样品起源有较大出入。

此外，在研究手段上，早期使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低，难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平。

SNP被称为第三代分子标记，是基因组中单个核苷酸的突变而引起的DNA序列的多态性，它以单个碱基的颠换、转换、插入和缺失的方式存在。

相较于其他分子标记，SNP具有以下几个有点：1)密度高，分布广，SNP分布广泛，遍布整个基因组；2)遗传稳定性，相较于SSR 等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性；3)二态性，尽管SNP只有两种等位基因型，在个体中信息量相较于目前常用的SSR标记要少，但其高密度性和稳定性弥补了这一差距；4)代表性，某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素；5)易于实现分析的自动化，无需检测片段长度多态，容易实现自动化。

由于以上特点，SNP经常被用作于遗传多样性研究、遗传连锁图谱的构建、种质资源鉴定和关联分析等研究。

技术内容
针对现有技术的不足，本技术的目的是提供香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，用以解决现有技术存在的使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低的问题；本技术的另一目的是提供香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟遗传多样性分析和古樟谱系分析中的应用，用以解决现有技术难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平的问题。

为了实现上述技术目的，本技术采用的技术方案为：
香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，包括11对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：CpSNP1上游引物如SEQ ID NO.1所示；
CpSNP1下游引物如SEQ ID NO.2所示；
CpSNP2上游引物如SEQ ID NO.3所示；
CpSNP2下游引物如SEQ ID NO.4所示；
CpSNP9上游引物如SEQ ID NO.5所示；
CpSNP9下游引物如SEQ ID NO.6所示；
CpSNP13上游引物如SEQ ID NO.7所示；
CpSNP13下游引物如SEQ ID NO.8所示；
CpSNP14上游引物如SEQ ID NO.9所示；
CpSNP14下游引物如SEQ ID NO.10所示；
CpSNP15上游引物如SEQ ID NO.11所示；
CpSNP15下游引物如SEQ ID NO.12所示；
CpSNP16上游引物如SEQ ID NO.13所示；
CpSNP16下游引物如SEQ ID NO.14所示；
CpSNP18上游引物如SEQ ID NO.15所示；
CpSNP18下游引物如SEQ ID NO.16所示；
CpSNP19上游引物如SEQ ID NO.17所示；
CpSNP19下游引物如SEQ ID NO.18所示；
CpSNP20上游引物如SEQ ID NO.19所示；
CpSNP20下游引物如SEQ ID NO.20所示；
CpSNP21上游引物如SEQ ID NO.21所示；
CpSNP21下游引物如SEQ ID NO.22所示。

多态性引物的PCR-HRM扩增体系为：上下游引物各10μM，1μL；2×Froget-Me-NotEvaGreen qPCR Master Mix 5μL，H2O 2μL，DNA模板30ng，1μL，体系的总体积为10μL。

多态性引物的PCR-HRM扩增程序为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，30-35个循环；
95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟遗传多样性分析中的应用。

香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟谱系分析中的应用。

上述应用，包括以下步骤：
1)提取不同品种香樟的基因组DNA；
2)用权利要求1SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示的引物对步骤1)提取的基因组DNA进行PCR 扩增和HRM分析；
3)数据分析叶绿体SNP位点多态性，古樟谱系分析，古樟遗传多样性分析。

有益效果：与现有技术相比，本技术筛选了11对香樟叶绿体基因组SNP分子标记的多态性引物，将其应用在古樟遗传多样性分析和古樟谱系分析中，基于叶绿体单倍型分析显示，不同单倍型分布差异明显，大部分单倍型只存在于特定的群体中，只有少数单倍型为共享单倍型，表明单倍型间存在一定的地理分化。

18个古樟群体的遗传分化系数Fst为0.212，基因流Nm为0.929，表明古樟群体间存在中等的基因流。

本技术的SNP分子标记重复性好，能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。

附图说明
图1是部分单倍体网络图。

具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本技术，但这些实施例并不用来限制本技术。

实施例1
1)供试材料
供试材料来源于香樟自然分布区的18个群体，分别为四川泸州、江西靖安、江西宁都、四川
宜宾、贵州道真、广西桂林、江西恩江、江西龙岗、安徽安庆、江西乐安、江西瑞洪、江西萍乡、广东广州、江西南昌、贵州贵阳、贵州荔波、福建武夷山和江苏南京。

选择胸径大于60cm的古樟树，每个个体采集5-10片新鲜叶片干冰运输，经液氮速冻于-80℃冰箱保存。

具体采集群体位置、经纬度、样本数等见表1。

表1 18个古樟群体采样信息
来源样本量群体经度纬度
四川泸州11SCLZ105.2628.58
四川宜宾5SCYB104.2528.25
江西靖安7JXJA115.1528.54
江西宁都10JAND115.5126.26
江西恩江6JXEJ115.4327.31
江西龙岗5JXLG115.6026.75
江西瑞洪21JXRH116.4328.88
江西萍乡10JXPX114.0627.64
江西南昌31JXNC115.8228.75
江西乐安11JXLA115.7327.28
贵州道真5GZDZ107.4328.45
贵州贵阳15GZGY106.7226.63
贵州荔波5GZLB107.8925.42
广西桂林5GXGL110.3025.17
安徽安庆14AHAQ117.0430.51
广东广州5GDGZ113.3623.19
福建武夷山10FJWYS117.9627.67
江苏南京15JSNJ118.8432.05
2)香樟总DNA提取与检测
采用改良后的CTAB法进行香樟总DNA的提取，具体操作步骤如下：
打开水浴锅，设置65℃预热；
取10mL离心管，加入4mL CTAB裂解液与80μL的β-巯基乙醇，放入水浴锅中进行预热；
取2g左右香樟叶片，放入预先准备好的研钵中，导入液氮研磨，直至样品呈均匀粉末状，加入上一步骤中的离心管中，放入水浴锅65℃水浴30min，期间每隔5min颠倒混匀；
取出离心管，置于冰上冷却三分钟后，加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后放入离心机中4℃、12000r离心10min；
准备新的10mL离心管，用移液器吸取上清液至新离心管中，再次加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后置于离心机中，4℃、12000r离心10min；
分别吸取500μL的上清液，分装入3个1.5mL离心管中并分别加入1mL的乙醇和50μL的醋酸钠溶液，颠倒混匀放入冰箱-20℃静置2h，等待絮状物析出；将剩余上清液移至2mL离心管，置于冰箱-20℃备用；
准备新的1.5mL离心管，分别加入1mL75％的乙醇溶液，将3个离心管中析出的絮状物挑入新离心管中，涡旋1min，10000r离心5min；
小心倒掉乙醇溶液，再加入新的1mL75％乙醇溶液，重复上一步骤；
再次倒掉乙醇溶液，利用真空干燥仪进行干燥；
加入200μL 1×TE溶液，溶解3h，取出后进行离心，上清液即为所提取的DNA。

取少量提取好的香樟总DNA，利用NanoDrop 2000c(ThermoFisher Scientific)进行DNA样品质量和浓度检测；同时利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，通过观察条带是否弥散来检测DNA有无降解。

将DNA稀释至30ng/μL，-20℃保存。

3)叶绿体SNP引物扩增及筛选
基于现有的五个化学型的香樟叶绿体基因组，通过mafft软件进行比对获得SNP位点，利用Oligo软件对获得的位点进行引物设计，每对引物内只含有一个SNP位点，产物长度在100bp ～350bp之间，所有引物的Tm值均为60℃。

共设计了23对SNP引物，(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)经筛选得到11对特异性高具有多态的SNP引物(表2)。

利用ViiA 7Real-Time PCR System withFast 96-Well Block实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增及HRM(高分辨熔解曲线)分型。

表2叶绿体SNP引物序列信息
注：F：上游引物；R：下游引物
多态性引物的PCR-HRM扩增体系为：DNA模板30ng，1μL；上下游引物各10μM，1μL；
2×Froget-Me-Not EvaGreen qPCR Master Mix 5μL，H2O 2μL，体系的总体积为10μL。

多态性引物的PCR-HRM扩增程序为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，30-35个循环；
95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

4)数据分析
利用软件popgen32进行MAF(最小等位基因频率)、h(Nei多样性指数)、I(shannon多样性指数)的估算，利用软件powermarker进行PIC(多态信息含量)值的估算。

利用软件SHEsis对11个SNP位点进行单倍型数量和类型的统计。

利用DNAsp进行单倍型多态性分析、中性检验和失配分析并计算Fst和Nm，并利用PERMUT计算遗传分化参数Nst和Gst。

使用软件Network version 5.0.1.1，采用中央连接网络(Median-joining)模型对单倍型数据进行单倍型网络图的构建。

为了得到较为简洁且质量较高的Network图，本实施例选择Frequency>1来消除可能的错误信息位点，且对高变异位点进行降权处理，并利用Reduced-Median进行进一步分析。

5)叶绿体基因组SNP位点(cpSNP)多态性分析
利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术，对18个古樟群体的11个SNP位点进行基因分型。

利用popgen32和powermarker软件对分型结果进行最小等位基因频率(MAF)、Nei多样性指数(h)、shannon多样性指数(I)和多态信息含量(PIC)估算(表3)。

11个SNP位点中MAF、h、I和PIC值最高的均为SNP1(0.479、0.499、0.692、0.375)，最低的均为SNP18(0.027、0.052、0.124、0.051)，MAF、h、I和PIC的平均值分别为0.175、0.168、0.400和0.208，均表现出较低的遗传多样性。

SNP9和SNP18的MAF低于0.1，为低频等位基因。

表3 SNP位点多样性检测
SNPMAFhIPIC
SNP10.4790.4990.6920.375
SNP20.1510.2560.4240.223
SNP90.0970.1750.3180.160
SNP130.1290.2250.3850.200
SNP140.0750.1390.2670.130
SNP150.1020.1830.3300.167
SNP160.1240.2170.3740.193
SNP180.0270.0520.1240.051
SNP190.1720.2850.4590.244
SNP200.1080.1920.3410.174
SNP210.4620.4970.6900.374
平均0.1750.1680.4000.208
注：MAF：最小等位基因频率；h：Nei多样性指数；I：shannon多样性指数；PIC：多态信息含量。

6)基于cpSNP单倍型的古樟遗传多样性分析
利用软件SHEsis对所有古樟进行SNP单倍型统计，在186个个体中共检测到52种单倍型(表4)。

SNP单倍型在古樟群体间分布差异较大，其中H4分布范围最广，在12个群体种均有分布；其次是H13，在11个群体中有分布；H18、H17、H3、H16、H42、H9、H14、H15、
H39、H6、H8和H28分别在9、8、6、5、4、3、3、3、3、2、2、2个群体中有分布，其余单倍型均仅分布在一个群体中。

群体内SNP单倍型分布差异也很大(表5)，18个群体均含有一个以上的单倍型，单倍型种类分布最多的古樟群体是江西南昌(JXNC)，分布有17个单倍型，其次江西瑞洪(JXRH)群体有13个单倍型，可能是这两个群体的样本数量相较于其他群体较大所导致。

江西龙岗(JXLG)和贵州荔波(GZLB)群体所含单倍型数量最少，为2个。

利用DNAsp对群体SNP单倍型多态性指数(Hd)进行估算(表5)，其中单倍型多态性最高的为SCYB群体(Hd为1)，最低的为GZLB群体(Hd为0.4)。

18个群体的总体SNP单倍型多态性为0.817，相对较高。

基于52种SNP单倍型，利用DNAsp软件对古樟群体的遗传分化系数进行估算，结果显示Fst 为0.212，基因流Nm为0.929，表明群体间拥有中等水平的基因流。

同时还利用软件PERMUT 进行Nst和Gst的计算，结果表明Gst(0.105)小于Nst(0.239)，但P值大于0.05，结果不显著，说
明SNP单倍型信息无法确定古樟群体分布是否具有明显的谱系地理模式。

表4单倍型的分布
表5单倍型多样性统计
POP ID个体数N单倍型数Nh单倍型多态性指数Hd
SCLZ1170.891
SCYB551.00
JXJA750.905
JXND1070.867
JXEJ630.600
JXLG520.600
JXRH21130.952
JXPX1080.956
JXNC31170.929
JXLA1150.618
GZDZ540.900
GZGY1080.956
GZLB520.400
GXGL540.900
AHAQ1460.747
GZDZ530.800
FJWYS1050.800
JSNJ1590.886
7)基于cpSNP单倍型的古樟谱系分析
单倍型网络图结果如图1所示，其结构为网状模式，单倍型H3处于整个网络的中心位置，可能是核心的古老单倍型。

以缺失的单倍型为分界线，可以分为上下两个支系，CladeⅠ由
H8、H6和H27组成，其余单倍型组成CladeⅡ。

CladeⅠ包含的单倍型主要分布于四川泸州(SCLZ)、四川宜宾(SCYB)和贵州贵阳(GZGY)群体，还有少部分分布于江西群体。

CladeⅡ的单倍型则广泛分布于全国各地。

江西地区的群体单倍型种类最丰富，包含了除H6和H8外所有的单倍型，是单倍型的分布中心。

需要注意的是，以上列举的仅是本技术的若干个具体实施例。

显然，本技术不限于以上实施例，还可以有许多变形。

本领域的普通技术人员能从本技术公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本技术的保护范围。

序列表
<110> 南京林业大学;江西省科学院生物资源研究所
<120> 香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用
<130> 1
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP1 primer F(artificial)
<400> 1
acaatgagga gcaaccaa 18
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> CpSNP1 primer R(artificial) <400> 2
acgcataccc aacgaa 16
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP2 primer F(artificial) <400> 3
ggaatggtgg agaaacaa 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> CpSNP2 primer R(artificial) <400> 4
ccgaagagag ggaagag 17
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> CpSNP9 primer F(artificial) <400> 5
ttcgttgggt atgcgt 16
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP9 primer R(artificial) <400> 6
attcctgggt ttctgatt 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> CpSNP13 primer F(artificial) <400> 7
ctaaacaact caatgcttct 20
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> CpSNP13 primer R(artificial) <400> 8
ggaatcggga gtatca 16
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP14 primer F(artificial) <400> 9
ttcctttact ggcttcgg 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> CpSNP14 primer R(artificial) <400> 10
actactgtac gaccaaccaa 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP15 primer F(artificial) <400> 11
ataaccttcc caaccacg 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP15 primer R(artificial) <400> 12
atagaaacga tggaagcc 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP16 primer F(artificial) <400> 13
gttattgcgt ggaagtgc 18
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> CpSNP16 primer R(artificial) <400> 14
ggacctgaaa taccttgct 19
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> CpSNP18 primer F(artificial) <400> 15
gaaccgtaca cgcacct 17
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP18 primer R(artificial) <400> 16
caatacatca atgagggg 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP19 primer F(artificial)
<400> 17
attcctattt acggcgac 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP19 primer R(artificial) <400> 18
aaccctgtag accatccc 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP20 primer F(artificial) <400> 19
tcgtaacaag gtagccgt 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP20 primer R(artificial) <400> 20
caaaagcgag agaaagcc 18
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> CpSNP21 primer F(artificial) <400> 21
tctgcccgac aacaac 16
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> CpSNP21 primer R(artificial) <400> 22
cccaatccat gaatctaa 18。