荧光原位杂交技术
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对，结合成专一的核酸杂交分子，再经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细 胞或组织上的位置显示出来的一项技术。
该技术最早是Pardue and Gall (1969)和John et al. (1969)分别独立建 立起来的。当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列 DNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分 重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对 的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技 术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。
非放射性标记法
直接法
荧光素（fluorescein）或其他荧光染料
间接法
地高辛（digoxigenin） 生物素（biotin）
1. 随机引物法 2. 缺口平移法 3. PCR法 4. 寡核苷酸末端标记法 5. 直接在探针3’或5’端合成
1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul
5种荧光素联合标记人类24条染色体
荧光素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
FITC ☆
☆☆ ☆
☆☆ ☆
☆☆☆ ☆
Cy3
△ △ △ △ △△
△
△
△△
Cy3.5
○
○○
○○ ○○
○○ ○ ○
Cy5
※※※※
※※
※※※※
4. 混匀离心，置于37℃温育1小时~20小时
5. 65 ℃处理10min终止反应
染色体标本变性
共变性
杂交液加到标本上封片，置80 ℃烘箱中10分钟
分别变性
70%甲酰胺，2xSSC 70 ℃处理2分钟 70%，85%，100%冷乙醇系列脱水，空气干燥
杂交
1. 杂交液(50% 去离子甲酰胺, 2x SSC, 10% 硫酸葡聚 糖, 50 mM 磷酸钠; pH 7)中加入标记的探针，每 10ul杂交液含50ng探针
2. 探针95 ℃变性5分钟，置冰水中10分钟 3. 10ul杂交液加到标本上，盖盖玻片并封片 4. 湿盒中37℃杂交过夜
杂交后洗脱
1. 2x SSC, 50%甲酰胺45 ℃洗3x5min 2. 2x SSC 37℃洗2x5min 3. TNT buffer [100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
2）用2x SSC洗3×5min 3）70%，80%，100%乙醇系列脱水，每级5分钟
2、胃蛋白酶处理
1） 0.005-0.02% pepsin（10 mM HCl） 37℃处理10 min 2） 1×PBS洗2×5min 3） 1×PBS，50 mM MgCl2处理5min 4） 1×PBS，50 mM MgCl2,1%甲醛固定10min 5） PBS洗涤并脱水,气干
镜子
干涉仪
发射光谱
通过光谱分析准确分 析A图中的色彩分为相 近的三种染色体（C图）
收集光线 标本
CCD相机傅立 叶转换
分析光谱信息
Chromosome Lab
该技术操作简单，只需进行一次杂交，一次拍摄， 而传统M-FISH在拍摄过程中要变换多次滤光片。 该技术灵敏度高，由于摒弃了传统M-FISH采用的 以滤光片为基础的成像技术，在拍摄过程中全光 谱通过，因此光通过量大大提高，从而提高灵敏 度。 分析准确率高 ，整个分析基于光谱信息，所以准 确率极高，即使是染色体末端的微弱信号，也同 样可以采集到。
Chromosome Lab
利用SKY 技术，准 确判断出7 号染色体 和12号染 色体之间 的交叉易 位。
Chromosome Lab
G带分 析得到 一条 marker 染色体 无法确 认起源， 用SKY 确定来 源于18 号。
Chromosome Lab
Fiber-FISH
DNA纤维的制备是先将单细 胞悬浮液涂在载玻片上，然后利 用碱变性剂或 EDTA-SDS缓冲液等 化学方法将染色体的结构破坏， 让DNA分子与复合的蛋白质分离而 形成游离的DNA纤维，再以这种失 去空间结构的线性DNA分子作为靶 DNA的载体进行原位杂交，使分辨 率和灵敏度都有了很大的提高。
影响杂交的因素
一、影响杂交的主要因素
温度、pH、单价阳离子浓度、甲酰胺
二、其他因素
探针长度、探针浓度、硫酸葡聚糖、洗H技术的应用
基因定位 染色体结构变异(异位、缺失、重复)研究 染色体物理作图 疾病及产前诊断 外源基因检测 多倍体起源进化研究 分子核型研究 染色体（质）空间结构研究
Chromosome Lab
在不同靶DNA上荧光原位杂交技术的比较
靶DNA结构 分辨率水平 可检测DNA
优点和缺点
序列范围
中期染色体 1——3Mb
>1Mb
保持染色体结构，切片容易制备
分辨水平低，识别染色体困难
前期染色体 200Kb
>200Kb 保持染色体结构,分辨水平居中
切片不易制备,识别染色体困难
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术
第一节 原位杂交技术简介 第二节 荧光原位杂交技术的应用 第三节 原位杂交操作步骤 第四节 影响杂交的因素 第五节 荧光原位杂交技术的新进展
原位杂交技术简介 in situ hybridization
原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则， 将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与经过变性后的单链DNA互补配
FF
NaCl, 0.05% Tween 20] 37℃洗1x5min
免疫细胞化学检测
1. TNT buffer冲洗 2. TNB buffer[100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
NaCl,0.5% blocking reagent] 3. Anti-DIG-荧光素(2 μg/ml, in TNB)37℃30min 4. TNT buffer冲洗3x5min 5. 乙醇系列脱水,气干 6. DAPI染色10min 7. 加Vectashield封片,荧光显微镜下观察并照相
Cy7
◆
◆
◆
◆◆◆◆ ◆ ◆ ◆
Chromosome Lab
光谱核型分析（spectral karyotyping ,SKY)
SKY是另一种M-FISH,实验操作和结果与MFISH相似。
原始图像利用干涉仪产生干涉信号，再采用高性 能CCD数码相机进行拍摄，得到一组不同光程差 的干涉图像。 再将所得数据做FFT(快速傅立叶 变换), 得到每一点的光谱信息。 通过分析光谱信 息，发现原始图像的信息。
荧光原位杂交技术新进展
M-FISH，armFISH(42-color M-FISH), SKY BAC-FISH, YAC-FISH Fiber-FISH PRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位DNA 合成技术 IS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位PCR GISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交 Immuno-FISH 3D-FISH Q-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISH T-FISH（Tissue-FISH）or (Telomere-FISH) RNA-FISH
拉长的中期染色体 200Kb
>200Kb 保持染色体着丝点端粒结构，分辨
率水平居中，拉长染色体不均匀
粗线期染色体 100Kb
>100Kb 保持染色体结构，识别染色体可能，
分辨率水平较高，切片不易制备
间期细胞核 50Kb
50Kb-2mb 分辨率水平高，切片容易制备，无
染色体结构，
游离染色质丝 10Kb
原位杂交操作步骤
一、准备载玻片和固定材料 二、染色体标本制备和预处理 三、探针制备及标记 四、染色体标本变性 五、杂交 六、杂交后洗脱 七、免疫细胞化学检测 八、荧光显微镜观察及显微摄影
染色体标本制备
预处理
1、RNA酶处理
1） 每张玻片加100 μl 100 μg/ml RNase A (in 2x SSC) 37℃处理1小时
2. 沸水浴中变性10min, 马上置于冰水中
3. 加入4ul DIG-High Prime(5x buffer; 50% glycerol;1 U/μl Klenow enzyme; 5x
random primer mix; 1 mM each of dATP, dCTP, and dGTP; 0.65 mM dTTP; and 0.35 mM DIG-11-dUTP)
10Kb-1mb 分辨率水平高，无染色体结构
DNA纤丝
1Kb
1Kb-1mb 分辨水平高，无染色体结构
Chromosome Lab
基因组原位杂交（GISH）
RNA-FISH
T-FISH
蚕豆
红小豆
黄豆
豇豆
绿豆
水 稻
小 麦
玉 米
金不换
水仙
鼠杂交瘤
猪
水稻BAC-FISH
日 本 晴 AA
该技术最早是Pardue and Gall (1969)和John et al. (1969)分别独立建 立起来的。当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列 DNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分 重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对 的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技 术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。
非放射性标记法
直接法
荧光素（fluorescein）或其他荧光染料
间接法
地高辛（digoxigenin） 生物素（biotin）
1. 随机引物法 2. 缺口平移法 3. PCR法 4. 寡核苷酸末端标记法 5. 直接在探针3’或5’端合成
1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul
5种荧光素联合标记人类24条染色体
荧光素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
FITC ☆
☆☆ ☆
☆☆ ☆
☆☆☆ ☆
Cy3
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Cy3.5
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○○
○○ ○○
○○ ○ ○
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※※
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4. 混匀离心，置于37℃温育1小时~20小时
5. 65 ℃处理10min终止反应
染色体标本变性
共变性
杂交液加到标本上封片，置80 ℃烘箱中10分钟
分别变性
70%甲酰胺，2xSSC 70 ℃处理2分钟 70%，85%，100%冷乙醇系列脱水，空气干燥
杂交
1. 杂交液(50% 去离子甲酰胺, 2x SSC, 10% 硫酸葡聚 糖, 50 mM 磷酸钠; pH 7)中加入标记的探针，每 10ul杂交液含50ng探针
2. 探针95 ℃变性5分钟，置冰水中10分钟 3. 10ul杂交液加到标本上，盖盖玻片并封片 4. 湿盒中37℃杂交过夜
杂交后洗脱
1. 2x SSC, 50%甲酰胺45 ℃洗3x5min 2. 2x SSC 37℃洗2x5min 3. TNT buffer [100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
2）用2x SSC洗3×5min 3）70%，80%，100%乙醇系列脱水，每级5分钟
2、胃蛋白酶处理
1） 0.005-0.02% pepsin（10 mM HCl） 37℃处理10 min 2） 1×PBS洗2×5min 3） 1×PBS，50 mM MgCl2处理5min 4） 1×PBS，50 mM MgCl2,1%甲醛固定10min 5） PBS洗涤并脱水,气干
镜子
干涉仪
发射光谱
通过光谱分析准确分 析A图中的色彩分为相 近的三种染色体（C图）
收集光线 标本
CCD相机傅立 叶转换
分析光谱信息
Chromosome Lab
该技术操作简单，只需进行一次杂交，一次拍摄， 而传统M-FISH在拍摄过程中要变换多次滤光片。 该技术灵敏度高，由于摒弃了传统M-FISH采用的 以滤光片为基础的成像技术，在拍摄过程中全光 谱通过，因此光通过量大大提高，从而提高灵敏 度。 分析准确率高 ，整个分析基于光谱信息，所以准 确率极高，即使是染色体末端的微弱信号，也同 样可以采集到。
Chromosome Lab
利用SKY 技术，准 确判断出7 号染色体 和12号染 色体之间 的交叉易 位。
Chromosome Lab
G带分 析得到 一条 marker 染色体 无法确 认起源， 用SKY 确定来 源于18 号。
Chromosome Lab
Fiber-FISH
DNA纤维的制备是先将单细 胞悬浮液涂在载玻片上，然后利 用碱变性剂或 EDTA-SDS缓冲液等 化学方法将染色体的结构破坏， 让DNA分子与复合的蛋白质分离而 形成游离的DNA纤维，再以这种失 去空间结构的线性DNA分子作为靶 DNA的载体进行原位杂交，使分辨 率和灵敏度都有了很大的提高。
影响杂交的因素
一、影响杂交的主要因素
温度、pH、单价阳离子浓度、甲酰胺
二、其他因素
探针长度、探针浓度、硫酸葡聚糖、洗H技术的应用
基因定位 染色体结构变异(异位、缺失、重复)研究 染色体物理作图 疾病及产前诊断 外源基因检测 多倍体起源进化研究 分子核型研究 染色体（质）空间结构研究
Chromosome Lab
在不同靶DNA上荧光原位杂交技术的比较
靶DNA结构 分辨率水平 可检测DNA
优点和缺点
序列范围
中期染色体 1——3Mb
>1Mb
保持染色体结构，切片容易制备
分辨水平低，识别染色体困难
前期染色体 200Kb
>200Kb 保持染色体结构,分辨水平居中
切片不易制备,识别染色体困难
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术
第一节 原位杂交技术简介 第二节 荧光原位杂交技术的应用 第三节 原位杂交操作步骤 第四节 影响杂交的因素 第五节 荧光原位杂交技术的新进展
原位杂交技术简介 in situ hybridization
原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则， 将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与经过变性后的单链DNA互补配
FF
NaCl, 0.05% Tween 20] 37℃洗1x5min
免疫细胞化学检测
1. TNT buffer冲洗 2. TNB buffer[100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
NaCl,0.5% blocking reagent] 3. Anti-DIG-荧光素(2 μg/ml, in TNB)37℃30min 4. TNT buffer冲洗3x5min 5. 乙醇系列脱水,气干 6. DAPI染色10min 7. 加Vectashield封片,荧光显微镜下观察并照相
Cy7
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Chromosome Lab
光谱核型分析（spectral karyotyping ,SKY)
SKY是另一种M-FISH,实验操作和结果与MFISH相似。
原始图像利用干涉仪产生干涉信号，再采用高性 能CCD数码相机进行拍摄，得到一组不同光程差 的干涉图像。 再将所得数据做FFT(快速傅立叶 变换), 得到每一点的光谱信息。 通过分析光谱信 息，发现原始图像的信息。
荧光原位杂交技术新进展
M-FISH，armFISH(42-color M-FISH), SKY BAC-FISH, YAC-FISH Fiber-FISH PRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位DNA 合成技术 IS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位PCR GISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交 Immuno-FISH 3D-FISH Q-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISH T-FISH（Tissue-FISH）or (Telomere-FISH) RNA-FISH
拉长的中期染色体 200Kb
>200Kb 保持染色体着丝点端粒结构，分辨
率水平居中，拉长染色体不均匀
粗线期染色体 100Kb
>100Kb 保持染色体结构，识别染色体可能，
分辨率水平较高，切片不易制备
间期细胞核 50Kb
50Kb-2mb 分辨率水平高，切片容易制备，无
染色体结构，
游离染色质丝 10Kb
原位杂交操作步骤
一、准备载玻片和固定材料 二、染色体标本制备和预处理 三、探针制备及标记 四、染色体标本变性 五、杂交 六、杂交后洗脱 七、免疫细胞化学检测 八、荧光显微镜观察及显微摄影
染色体标本制备
预处理
1、RNA酶处理
1） 每张玻片加100 μl 100 μg/ml RNase A (in 2x SSC) 37℃处理1小时
2. 沸水浴中变性10min, 马上置于冰水中
3. 加入4ul DIG-High Prime(5x buffer; 50% glycerol;1 U/μl Klenow enzyme; 5x
random primer mix; 1 mM each of dATP, dCTP, and dGTP; 0.65 mM dTTP; and 0.35 mM DIG-11-dUTP)
10Kb-1mb 分辨率水平高，无染色体结构
DNA纤丝
1Kb
1Kb-1mb 分辨水平高，无染色体结构
Chromosome Lab
基因组原位杂交（GISH）
RNA-FISH
T-FISH
蚕豆
红小豆
黄豆
豇豆
绿豆
水 稻
小 麦
玉 米
金不换
水仙
鼠杂交瘤
猪
水稻BAC-FISH
日 本 晴 AA