荧光原位杂交技术(FISH)常见问答
FISH——荧光原位杂交
FISH ——荧光原位杂交摘要：21三体综合征是怎样用FISH来诊断的？知识点：原位杂交菌落原位杂交荧光原位杂交( F luorescence I n S itu H ybridization, FISH)正常细胞异常细胞？21三体综合征的FISH产前诊断分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交原位杂交(in situ hybridization, ISH) 使探针进入细胞或组织内与待测核酸进行特异性结合形成杂交体从而对待测核酸进行细胞内定位1. 根据待测核酸序列信息设计合成带标记的特异性探针2. 制备待测样本(组织切片/细胞爬片)3. 经变性与复性探针与序列互补的待测靶核酸杂交4. 进行靶核酸的定位检测观察4. 进行靶核酸的定位检测观察 核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P 、3H 、35S 等2.非放射性标记：荧光素等 1. 放射性原位杂交2. 荧光原位杂交 ( F luorescence I n S itu H ybridization, FISH) 原位杂交的分类含有目的基因的阳性菌落菌落原位杂交4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交 ( F luorescence I nS itu H ybridization, FISH)采用荧光素标记的探针与待测样本中的靶核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，达到对染色体或基因异常的细胞或组织标本进行检测诊断4. 进行靶核酸的定位检测观察21三体综合征的FISH产前诊断21号待检染色体的特异探针(红色) 和13号对照染色体的特异探针(绿色)与羊水间期细胞进行荧光原位杂交FISH20号染色体着丝粒探针(红色) 和20号染色体基因座特异性探针(绿色)20号染色体微缺失的FISH 检验荧光原位杂交检测染色体易位染色体核型分析检测染色体易位4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交的临床应用先天性疾病检验唐氏综合征肿瘤疾病检验慢性粒细胞白血病感染性疾病检验HPV、HBV4. 进行靶核酸的定位检测观察荧光原位杂交的临床应用常规诊断标本：全血、骨髓细胞、口腔细胞、精细胞、子宫颈细胞等产前诊断标本：羊水细胞、绒毛细胞等4. 进行靶核酸的定位检测观察FISH ——荧光原位杂交 安全无污染 快速 直观 特异。
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应用
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应⽤我接触“FISH”也是刚刚两年多的时间，作为⼀个“初学者”刚开始接触“FISH”可能跟⼤多数⼈⼀样满脑⼦的疑惑：“FISH”是做什么的?有什么临床作⽤呢?那些红红绿绿的点都是些什么意思?……今天让我们慢慢的去揭开FISH的不太神秘的⾯纱。
1.FISH的前世今⽣在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交⽅法，检测间期染⾊体和分裂期染⾊体上特定DNA和RNA序列的⽅法，该⽅法存在操做⽐较⿇烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较⾼等问题，故⽬前弃之不⽤。
20世纪80年代⽤⾮放射性半抗原如⽣物素进⾏核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使⽤这种⾮放射性标记⽅法。
随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应⽤于分析细胞分裂期染⾊体铺⽚的DNA序列。
相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、⼲扰信号少、⼀张玻⽚可以标记多种颜⾊探针等优点。
这些优点逐渐使FISH成为⼀种研究分⼦细胞遗传学很好的⽅法。
FISH即染⾊体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从⽽获得细胞核内染⾊体或基因状态的信息。
FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了⼀门新的学科——分⼦细胞遗传学。
（如下图所⽰)2.FISH信号解读-红红绿绿是什么⽬前临床上⽤于FISH检测的探针的荧光素⼤都是绿⾊的和橙红⾊标记，可⼤致分为：染⾊体计数(着丝粒)探针(centromere-enumerationprobes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes，LSI)，染⾊体涂染(paint，WCP)探针。
其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在⾎液病诊断与预后分型中最为常⽤。
什么是荧光原位杂交（FISH）？
什么是荧光原位杂交（FISH）？“关于FISH实验的一些内容。
”近来，有伙伴在后台咨询了荧光原位杂交(FISH)实验的相关知识，因此小编想在今天推文简单聊一聊FISH实验，也讲点新花样。
另：大家可以在后台私信学术问题，互相探讨。
小编也会考虑将相关内容整理，以推文形式发出来。
补充：那些在百度网盘添加好友的伙伴记得要通过一下，否则小编没法给你们发送X-mind链接呀。
01—什么是FISHFISH：采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显示，最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。
上一代的FISH还是采用的同位素进行标记，现在基本上都是荧光标记了。
在此，要感谢J.G.Baunlan这位大神了。
有了FISH，我们可以不再仅仅依赖分子生物学的方法来检测DNA 的表达了。
FISH技术最大的优点是可以在间期细胞核上直接观察到DNA扩增，并且荧光信号的强度直接与DNA扩增水平直接相关。
这些都大大促进了分子细胞遗传领域的科学研究，同时也是临床上诊断肿瘤的利器。
02—FISH的实验要点网上有很多关于FISH的实验步骤教程，但每个探针盒子的操作可能存在差异。
懂了原理，才能以不变应万变。
因此，本部分主要是详细讨论实验要点。
FISH的大致步骤分为探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(适用于适用生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。
要点：（1）良好的前期标本制备十分重要，这点对于采用秋水仙素刺激得到中期染色体分裂象尤为重要。
刺激时间过短或过长都会影响实验观察，因此需要耐心摸索作用时间。
（2）蛋白酶K的作用浓度。
浓度高了极易影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。
石蜡切片一般要达到10-30min，不要超过半小时，一般来说，20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。
FISH技术全攻略
FISH（荧光原位杂交）技术全攻略荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核酸序列位置的方法。
该技术问世与70年代中期左右，其曾多于与染色体异常的研究，近年来随着FISH探针种类的不断增多，使得该技术逐步应用于各种领域。
该技术具有快速，安全，灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学，肿瘤生物学，基因定位，基因作图，基因扩增及分子诊断等领域。
1对于FISH操作来说，那些因素比较重要？在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳定性。
2 如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。
如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内）。
其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。
此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。
同时检测的样本最好不能超过4块。
操作中的行动一定要迅速。
操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。
特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。
因此对上述小部件的要进行预热处理，不然会影响FISH 的杂交效果。
3 使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急剧衰减，几分钟后信号就消失了。
FISH荧光原位杂交
(1) 玻片预处理玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，清水浸泡过夜；1%的盐酸浸泡24小时，蒸馏水清洗干净后置0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）中浸泡过夜。
硅化处理：将载玻片和盖玻片用1%的盐酸煮沸10min后，用0.1%DEPC处理的蒸馏水冲洗，60℃烘干。
盖玻片用锡纸包好4℃保存备用。
黏附剂涂片制备：载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液中约1min，取出用灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥，然后置4℃保存备用。
(2) 样品采集和预处理取样：用经高压灭菌的聚乙烯管子取湿地基质并称量，加灭菌蒸馏水适量振荡混匀，超声波处理使细菌分散。
取清洗下来的悬浊液约1ml进行后续处理。
样品固定与清洗：悬浊液中按1:1加入4%多聚甲醛于4℃固定24小时；将固定样本用磷酸缓冲液(PBS)10000r/min离心漂洗二次，弃去上清液。
用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于-20℃保存备用。
热固定与脱水：取10μl样品在载玻片上涂抹24mm×24mm大小，37℃的烘箱热固定2h 后依次用50%，80%，96%乙醇室温下脱水3min，室温干燥。
(3) 杂交反应硝酸菌的探针见表4.2：杂交液配置：总细菌、硝酸细菌、亚硝酸细菌杂交液中去离子甲酰胺（DAF）浓度分别为20%、40%或55%去离子甲酰胺（DAF），其余的相同，SDS 0.1%，Tris-HCl（pH8.0）20mmol/L，NaCl 900mmol/L。
表5-1硝酸菌与亚硝化细菌探针序列Tab. 5-1 Probe and sequences of nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and total bacteria 细菌探针名称探针序列（5’—3’）5’—标记总细菌EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT HEM硝酸细菌NIT3 CCT GTG CTC CA T GCT CCG FITCCNIT3* CCT GTG CTC CAG GCT CCG亚硝酸细菌NSO190 CGA TCC CCT GCT TTT CTCC HEXCNIT3* 为硝酸菌探针NIT3的竞争探针探针浓度均为50ng/μl。
免疫荧光原位杂交技术
免疫荧光原位杂交技术免疫荧光原位杂交（immunofluorescence in situhybridization，简称FISH）技术是一种目前被广泛应用于细胞和组织中的分子生物学技术。
它的应用范围涵盖了人类健康、疾病诊断、基因表达和细胞遗传等诸多领域。
本文将介绍FISH技术的原理、操作步骤及其在各个领域的应用，希望能对你有所启发。
首先，我们来了解一下FISH技术的基本原理。
FISH技术结合了免疫荧光和原位杂交两种方法，可以同时检测细胞或组织中的特定DNA序列与特定蛋白质的共定位。
通过标记特定的DNA探针和特定的抗体，可以在细胞或组织中检测到目标分子的位置和表达水平。
使用FISH技术的步骤如下：首先，应选择合适的标记方法和荧光探针。
标记方法常用的有直接标记和间接标记两种。
接着，将标记过的DNA探针与样本（细胞或组织）接触，使其与目标DNA序列杂交。
经过洗涤、固定和照相，可以观察到目标DNA序列的位置及其与蛋白质的共定位情况。
FISH技术在各个领域都有广泛应用。
在人类健康方面，FISH技术可用于遗传疾病的诊断、肿瘤基因分析和染色体异常的检测。
通过检测染色体畸变和基因突变，可以帮助医生准确判断疾病的种类和程度，为疾病的预防和治疗提供指导。
在基因表达研究中，FISH技术可用于检测特定基因的表达水平、研究基因组中的微小区域以及非编码RNA的研究。
通过观察目标基因在细胞中的表达情况，可以深入了解基因在生理和病理过程中的功能及其调控机制。
此外，在细胞遗传学中，FISH技术可用于研究染色体结构、染色体的分离和重组事件的发生机制。
通过观察染色体在细胞分裂过程中的运动轨迹，可以揭示染色体复制、分离和重组等关键生物学过程的机制。
综上所述，免疫荧光原位杂交技术是一种生物学研究中重要的分子生物学技术。
它可以帮助我们更全面地了解细胞和组织中的分子表达及其调控机制。
未来，随着技术的不断发展和创新，FISH技术将在医学诊断、基础科学研究和药物开发等领域发挥更加重要的作用。
荧光原位杂交技术操作的常见问题分析
荧光原位杂交技术操作的常见问题分析江冬瑞;王弦;吴强【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2015(031)012【总页数】2页(P1426-1427)【关键词】荧光原位杂交;免疫组织化学;临床病理;诊断【作者】江冬瑞;王弦;吴强【作者单位】安徽医科大学第二附属医院病理科,合肥230032;安徽医科大学第二附属医院病理科,合肥230032;安徽医科大学第二附属医院病理科,合肥230032【正文语种】中文【中图分类】R446江冬瑞，王弦，吴强目前，荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)因具有灵敏度高、特异性强、定位明确及结果客观等优点［1］，在临床上已应用于产前染色体数目检测、肿瘤基因检测，如多发性骨髓瘤检测和慢性淋巴细胞性白血病等的检测，担负着辅助病理诊断和指导临床用药的重任。
日常病理诊断中，应用FISH技术检测乳腺癌HER-2和TOP2A基因扩增，可以判断预后，指导靶向治疗和辅助化疗;在非小细胞肺癌中检测EGFR基因突变，可以筛选靶向治疗的适用人群;检测TERC基因用来进行子宫颈病变临床分级和预测子宫颈癌的进展［2］;另外在淋巴瘤和前列腺癌等方面，还有一些探针可以用于辅助诊断。
虽然FISH检测技术具有安全、试验周期短、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点［3］，被临床病理工作者广泛认可，但该技术操作相对复杂，检测价格昂贵，目前各实验室的条件不一，FISH检测技术的标准化和质量控制就显得格外重要。
安徽医科大学第二附属医院病理科经过反复实验摸索，于2010年4月建立FISH技术平台以来，现已成功开展HER-2 FISH检测180例，在此将操作注意事项及常见问题作一小结，以便与大家一同交流。
建立FISH技术平台，除需要一间可以进行荧光实验操作和显微观察暗室外，还需要原位杂交仪、荧光显微镜、显微镜滤光片、水浴箱、漩涡混合器、普通离心机、移液器、FISH探针试剂盒、无水乙醇、二甲苯、去离子水、橡胶水泥、透明指甲油等设备和试剂。
免疫荧光原位杂交技术FISH
变性杂交
结果统计
羊水标本玻片的制备
离心 胰酶消化 低渗（0.075M KCL） 预固定、固定 滴片（控制好悬液浓度、量、高度）
胰蛋白酶（Trypsin）消化
操作中要控制好酶的工作浓度,适量加大酶 有助于加强消化作用,但盲目加大酶量超过 酶饱和度不一定起到加强消化的作用。实 验中应控制好酶的工作浓度,不同批次、不 同储存时间及温度影响酶消化强度及饱和 度。
37º C 蛋白酶k 5-30min
洗片
DAPI染色
阅片
脱蜡
石蜡切片浸于二甲苯中3次,每次10分钟 浸入100%的乙醇中5分钟.然后梯度复水 各2分钟 浸入去离子水3分钟
(脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交率降低,荧光背景高等)
预处理
I. 100 º C沸水处理组织切片30分钟 II. 100ug/mL的蛋白酶K溶液,37 º C孵育5-30 分钟
HER-2基因扩增模式
肺癌细胞观察计数及结果分析
100X油镜下癌区随机计数100个细胞，计 算红绿信号的比值（Ratio） 扩增：I: Ratio>2 II:15copy>或=10% III:成簇扩增 IV： Ratio<2但4copy>或=40% 阴性：除以上扩增的情况
EGFR基因扩增检测试剂盒 （FISH）
低渗处理和固定
细胞置于KCL低渗溶液中吸收水分可使细胞 胀破，使探针更容易与核内DNA杂交结合 ，便于结果分析。
固定液（乙酸和甲醇1：3配比）加入后形 成核蛋白交联定型。提高细胞核与载玻片 的亲和力，使探针DNA易于进入细胞。
预处理
• • • • • • 37 º PBS 5min C 37 º 0.005%胃酶15min C 1xPBS 3min 1%多聚甲醛10min 1xPBS 3min 2次 梯度脱水
荧光原位杂交技术(FISH)常见问答
荧光原位杂交技术（FISH）常见问答1.对于FISH操作来说，那些因素比较重要?在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。
2.在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果?发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。
在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。
此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。
因此保证FISH操作中的温度非常重要。
3.该如何保证FISH 操作中的温度?最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。
如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内)。
其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。
此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。
同时检测的样本最好不能超过4块。
操作中的行动一定要迅速。
操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。
特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多(10ul)，因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。
因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。
4.使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。
但随后信号急剧衰减。
几分钟后信号就消失了。
这是探针本身的质量问题吗?在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。
出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。
阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。
它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。
该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。
然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。
接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。
最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。
1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。
通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。
此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。
2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。
在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。
DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。
选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。
其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。
乳腺癌HER2 FISH检测的问答
乳腺癌HER2 FISH检测的问答乳腺癌HER2状态问题与解答（答医生）什么是FISH？FISH（荧光原位杂交）是指以标记荧光分子的DNA为探针而其结果于荧光显微镜下观察的一类杂交。
“原位”是指固定于玻片标本的细胞核原有位置。
为了进行FISH分析，加热固定在玻片上的标本，使其染色体DNA伸展并将双链打开，令DNA探针易于与其结合，加上探针后冷却细胞，使DNA探针杂交于与其互补的靶序列，一旦杂交，探针上的荧光分子将于染色体上精确地显示靶DNA，依赖于靶DNA的设计，许多类型的遗传学改变都可以检测出来。
FISH的优势何在？1）细胞内相对稳定的DNA靶；2）逐个细胞定量分析遗传学改变；3）在完整细胞内同时分析多种遗传学靶；4）容易判读；5）容易操作；6）结果快速；FDA批准的FISH检测HER2实验用于以下目的：评价预后、基于阿霉素的化疗选择和赫赛汀治疗的选择。
DNA探针系统是怎样的？FISH标本分析需进行：1）肿瘤组织切片；2）探针与切片上的肿瘤组织细胞核内的HER2基因序列杂交；3）在荧光显微镜下观察结果FISH信号判读应采用薄层切片。
当处理肿瘤组织时，常会有“核截断”。
因大多数细胞核约10微米厚，所以4-6μm切片最佳。
操作者以计数荧光信号来客观地分析结果。
FISH探针的标记有几种？FISH已经是目前诊断实验室的主要技术之一，有两种标记探针的方法：直接标记和间接标记。
直接FISH：是采用了直接标记有荧光基团的探针，通过一步杂交，荧光信号即结合到靶序列上。
这种方法步骤很少、简便且快速。
非常适合临床诊断实验室。
目前所做的HER2基因状态评价的探针就是采用了直接标记的方法。
HER2基因评价由HER2基因特异性探针和17号染色体着丝粒探针共同完成。
间接FISH：是采用了半抗原标记的探针，多为地高辛或生物素标记，杂交后，以针对半抗原的荧光物质标记的抗体进行探针检测，例如采用抗地高辛抗体进行“夹层”分析。
间接FISH大多需要封闭试剂和多个扩增步骤，常存在荧光背景问题。
FISH实验问题分析与解答（精选案例）
FISH实验问题分析与解答（精选案例）大家在FISH判读时，总会遇到一些影响判读的因素，比如视野内杂质较多，信号点不够亮或淬灭等等，今天小编给大家介绍其中两个常见问题：杂质与信号弱，也精选了实验中不好的结果作为案例，跟大家分析可能出现的原因及解决方案。
大家在实验过程中还有其他的问题也可以踊跃在公众号留言，可能会被小编看到作为下期的主题哦。
01高荧光背景不合适的洗涤如果洗涤时间不足或溶液温度不够，则容易出现背景荧光。
在洗片之前必须用温度计来测量溶液的温度。
一次洗片不超过10片，如果有超过10片切片被洗涤，必须分次洗涤，在每次洗涤前再次升温并测量温度。
自然发生的背景石蜡切片中一些明显的背景荧光可能会迷惑经验不足的观察者。
首先要忽略粒细胞可能发出的明亮荧光，其次某些坚实的组织或杂质在各个荧光通道都会发出荧光。
单个的荧光点比较麻烦，但可以通过切换不同荧光通道来辨别，它们通常在各个通道都会发光，不要总是以覆盖核信号为标准来定义这些点。
背景信号有可能位于比正常FISH 信号更高的平面上。
案例一：黄色箭头指示绿色的背景荧光点。
这些点可能比正常的荧光信号大，有更清晰的边缘。
在各个荧光通道都发光且颜色更深。
有很多背景斑点的区域应该尽量被避开进行观察。
案例二：在该区域可见到高水平的绿色背景，应该避免检测这种区域。
使用窄通道的，专为探针设计的滤光片可以有效降低这种背景。
增加蛋白酶消化时间和更强烈的杂交后洗涤强度也可能有用。
案例三：强烈的绿色自发荧光导致绿色信号和核边缘难以被检测。
这种标本应该增加蛋白酶消化时间或适当延长煮片时间。
案例四：该乳腺癌标本的红色杂点又大又多，看起来非常像HER2成簇扩增，实际上认真观察可以发现，这些红点大部分都不在细胞核内，而且信号亮度大小都和正常信号有着很大的区别。
这种非常亮的自发荧光杂质不大容易通过延长洗涤时间或提高洗涤温度来去除，但是因为和信号点区别很大，且在各通道下都有强信号，可以在判读时自己区分。
荧光原位杂交考试题目
荧光原位杂交考试题目
荧光原位杂交（FISH）是一种现代生物学技术，将荧光素标记在核酸探针上，利用探针直接与染色体进行杂交。
以下是一些可能的考试题目：
1. 什么是荧光原位杂交（FISH）？
2. FISH的原理是什么？
3. FISH可以用来检测什么？
4. FISH与免疫组化（IHC）的根本区别是什么？
5. FISH与显色原位杂交（CISH）的根本区别是什么？
6. 人类细胞有多少对染色体？
7. FISH可以检测的染色体异常有哪些？
8. 染色体的长臂和短臂分别用什么表示？
以上是可能的考试题目，建议查阅相关教材或咨询专业人士，获取更全面和准确的信息。
荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的专家共识
荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的专家共识
荧光原位杂交技术（FISH）是一种基因诊断技术，常用于产
前诊断中检测染色体异常，特别是常见的三体综合征（唐氏综合征）、爱德华兹综合征和帕塔综合征。
以下是在产前诊断中应用FISH技术的专家共识：
1. FISH技术可以在短时间内提供准确的染色体异常诊断结果，对于怀疑胎儿存在染色体异常的孕妇进行快速筛查非常适用。
2. FISH技术相对于传统的染色体分析技术，具有更高的敏感
性和特异性。
它可以在单个细胞水平上检测染色体数目和结构异常，可检测到低于5%的减数分裂异常。
3. FISH技术可以通过使用特定的探针来检测染色体上的特定
基因或DNA序列，对染色体重排、微缺失和微重复等非整倍
体异常进行检测。
4. FISH技术与其他产前诊断技术（如羊水穿刺和绒毛活检）
相比，具有较低的侵入性，不会对胎儿产生明显的损害风险。
5. FISH技术的主要局限性是只能同时检测一小部分染色体异常，无法全面覆盖所有染色体异常。
因此，对于初步筛查结果异常的孕妇，可能需要进一步进行常规染色体分析。
6. FISH技术的检测结果需要由具有丰富经验的专业技术人员
进行解读和分析。
因此，在实际应用中需要高质量的实验室设备和专业技术的支持。
综上所述，FISH技术在产前诊断中具有重要的应用价值，可以作为一种快速、敏感和可靠的检测方法，帮助医生准确地评估胎儿染色体异常的风险。
然而，该技术的有限应用范围和结果的解读需要专业技术人员的支持，需要在临床中慎重使用。
最新常见血液肿瘤FISH检测小册资料
最新常见⾎液肿瘤FISH检测⼩册资料精品⽂档常见⾎液肿瘤FISH检测⼩册精品⽂档精品⽂档精品⽂档⼀.FISH是什么FISH即荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization），是在细胞遗传学⽔平上检测染⾊体及基因数⽬和结构异常的⼀种分⼦病理检测技术。
其基本原理是利⽤标记了荧光素的核酸作为探针，按照碱基互补原则，与待检样本中与之互补的核酸经过变性-退⽕⽽形成杂交双链核酸，然后通过荧光显微镜进⾏检测和分析。
FISH技术具有直观、快速、敏感性⾼和⽅便灵活等特点，⽬前已经⼴泛应⽤于临床的肿瘤遗传学及各种基因相关疾病的分型与个体化治疗等多个领域。
精品⽂档⼆.⾎液肿瘤的诊断分型MICM：⾎液肿瘤诊断的精确分型是临床选择正确治疗⽅案的前提，⽬前国际上通⽤的是结合细胞形态学（Morphology）、免疫学（Immunology）、细胞遗传学（Cytogenetics）和分⼦⽣物学（Molecular）的MICM分型。
形态学诊断(Morphology)细胞学：外周⾎、⾻髓涂⽚，淋巴结穿刺组织学：⾻髓、淋巴结活检精品⽂档精品⽂档●免疫学检查(Immunology)免疫组化（IHC），流式细胞（FCM）●细胞遗传学检查(Cytogenetics)核型分析，荧光原位杂交（FISH）●分⼦⽣物学检查(Molecular)PCR，DNA测序三.FISH技术的作⽤及优势FISH作为⼀项很重要的分⼦遗传学检测技术，在⾎液肿瘤的诊断中有很⼤的作⽤，得到了NCCN等国内外各⼤⾎液肿瘤诊疗指南的认可和建议。
⽬前与⾎液肿瘤相关的FISH探针有接近100种，常⽤的就有60种左右，包括急慢性⽩⾎病、⾻髓增⽣异常综合症（MDS）、多发性⾻髓瘤（MM）、淋巴瘤等多种⾎液精品⽂档精品⽂档肿瘤。
FISH技术的相对优势：●FISH技术更敏感，可检测出核型分析检测不出的细微缺失或易位，如MDS中的5q缺失综合征；●FISH技术不需要中期分裂相细胞，⽽核型分析需要培养时间较长且需要较⾼的操作要求；●FISH技术是在细胞形态的基础上进⾏结果判读，可有效地降低假阴性或假阳性的风险，⽽PCR技术经过倍增扩增，不能在形态的基础上判读，对实验要求⾼，易产⽣假阴性或假阳性。
荧光原位杂交(FISH)检测
目
CONTENCT
录
• 荧光原位杂交(fish)检测概述 • FISH检测的基本原理与技术流程 • FISH检测在临床诊断中的应用 • FISH检测的优势与局限性 • FISH检测的实际案例分析
01
荧光原位杂交(fish)检测概述
定义与特点
定义
荧光原位杂交（FISH）是一种基于荧光标记的DNA探针与目标DNA 结合，通过荧光显微镜观察并检测细胞内特定基因或染色体异常的 技术。
FISH技术可以应用于各种样本类型，如细胞、 组织切片、石蜡包埋组织等。
直接观察
FISH技术可以直接在细胞或组织的显微镜下观 察杂交信号，无需进行额外的染色或标记。
灵敏度高
FISH技术能够检测单个基因拷贝数的变化，灵 敏度较高。
局限性
成本高
FISH技术需要使用特殊的探针和 荧光染料，因此成本较高。
80%
基因突变
FISH技术可以检测基因突变，如 抑癌基因突变、致癌基因突变等 。
基因表达分析
基因表达水平
FISH技术可以检测基因表达水 平，了解基因在细胞中的表达 情况。
基因定位
FISH技术可以确定基因在染色 体上的位置，了解基因的染色 体定位。
基因互作
FISH技术可以检测基因间的相 互作用，了解基因间的关系。
细胞或组织的通透性处理
使用适当的试剂使细胞或组织的膜通透性增加，以便探针能 够进入。
杂交反应
探针与靶DNA的杂交
将制备好的探针与固定在样本上的靶 DNA进行杂交，形成探针-靶DNA复 合物。
去除未结合的探针
通过洗涤去除未结合的游离探针，提 高杂交信号的特异性。
信号检测与图像分析
原位杂交问答题
原位杂交问答题Questions:What are the principles of indirect in situ hybridizition histochemistry?What are the aims of pre-treatment in in situ hybridization histochemistry? how todo the pre-treatment?What is hybridization stringency? How to adjust hybridization stringency?What are the differences between in situ hybridizition histochemistry and Southernblotting/Northern blotting/immunohistochemistry?1 组化的基本原理和技术的基本要求2 ABC 法的原理特点并列出实验程序关键步骤3 免疫荧光双标记技术的简介发步骤的方法及其所需要的调价按和冰冻切片放冰晶形成与方法防冰晶方法有单纯OCT胶包埋法：讲新鲜组织迅速置于包埋托上再将组织的表面全部用OCT胶包埋后放入低置切片机内冷冻五分钟左右切片高渗透压脱水法:：将新鲜取材的组织迅速置于20%~30%的蔗糖溶液中置于冰箱4摄氏度过夜，待组织块沉底后PBS冲洗后用OCT胶包埋切片低温骤降冷法：将组织块植入低温环境中使组织骤冷降温4 原位杂交组化的基本原理特点及分类注意事项遵守原则试述间接原位杂交组化的基本原理过程及特点5 什么叫杂交前处理其目的试述杂交前处理的基本方法和原理意义和方法6 如何控制原位杂交组织化学原理的特异性7举例说明酶组织化学技术的原理和注意事项8试述免疫荧光组织化学基本原理简要说明双重免疫荧光标记技术的基本程序和应用（将两种抗体分别用不同的荧光素标记用来显示含有不同成分的两种细胞在同一区域的定位模式将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记用来定位同一细胞内存在的两种不同成分）9试述免疫组织化学技术和电镜免疫荧光组织化学技术的应用特点10试述原位杂交组织化学技术与免疫组织化学技术在应用上有何不同11什么是杂交严格度如何控制杂交严格度影响因素和作用12酸性磷酸酶铅法的反应原理乙酰胆碱酯酶和NO合酶的反应原理13请选择一种亲和免疫组织化学技术试述起技术原理并列出其反应程序中得关键步骤14试述间接方法双重免疫荧光双标记技术的原理主要步骤和注意事项15试以半抗原标记的cDNA探针进行原位杂交的基本原理和主要步骤16试述影响杂交体溶解温度的主要因素及根据17原位杂交实验的对照试验有哪些杂交前后的处理原则18什么叫做核酸探针理想的探针标记物应具备哪些条件以及核酸探针缺口平移方法19什么是寡核苷酸探针其设计原则是什么有何优缺点20试述过氧化物酶—抗过氧化物酶复合物法的主要原理及步骤简述反应时应注意的问题21原位杂交直接法和间接法的异同点原位杂交预处理的目的是什么怎样进行预处理22试述抗体经木瓜酶分解后的组成及各片段的活性分解产物23试述免疫胶体金双标记法的原理直接和间接法。
fish荧光原位杂交技术原理
fish荧光原位杂交技术原理荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因组的结构和功能。
该技术通过将荧光标记的探针与目标DNA序列进行特异性杂交，并通过观察荧光信号的强度和位置来确定目标DNA的存在和位置。
本文将详细介绍FISH技术的原理及其在生物学研究中的应用。
FISH技术的原理基于DNA互补配对的原理。
DNA是由脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）分子组成的，其中包含了遗传信息。
DNA的互补性决定了两条DNA链之间的配对方式。
在FISH中，需要合成一种探针，这种探针与目标DNA序列互补配对。
探针通常由一段标记有荧光染料的DNA序列构成。
荧光染料将会发出荧光信号，这样我们就可以通过观察这些信号来确定目标DNA的存在和位置。
探针的制备可以通过化学合成或使用PCR扩增的方式进行。
FISH技术可以用于研究多种生物学问题。
一种常见的应用是检测染色体的异常。
例如，通过使用指定的探针，可以确定染色体上是否有缺失、重复或转座等变异。
这对于遗传疾病的诊断和研究具有重要意义。
此外，FISH还可用于确定基因的位置和拷贝数。
通过使用互补的探针，我们可以确定目标基因在染色体上的位置，并计算出它的拷贝数。
这对于研究基因的表达调控、进化和遗传变异等方面都非常重要。
FISH技术在癌症研究中也有广泛的应用。
通过使用特异性的探针，可以检测癌细胞中特定的突变或基因重排事件。
这有助于了解癌细胞的致病机制以及寻找新的治疗靶点。
在实验操作上，FISH技术分为两个主要步骤：探针制备和杂交反应。
对于探针的制备，我们需要使用一段与目标DNA互补的DNA序列，并在其中加入荧光标记。
这可以通过化学合成或PCR扩增的方法实现。
在杂交反应中，我们需要将探针与待测样品中的DNA进行杂交反应。
这通常需要将样品固定在载玻片上，并与探针一起进行荧光杂交。
FISH检测相关
临床诊断中的的FISH检测FISH（即荧光原位杂交）技术作为分子诊断的重要工具，在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。
FISH检测是利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA探针与样本DNA进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，以此作为诊断的依据。
FISH的操作简便快捷，结果直观准确，因此FISH成了许多疾病诊断的首选工具。
下面我们将从探针的设计，样本的制备，原位杂交和检测结果的观察等几个方面简单介绍FISH的操作。
探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。
FISH检测的准确性来源于探针的设计。
FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。
用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。
而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。
荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。
以著名的探针生产商V ysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb-400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号，而无需抗原-抗体反应对荧光信号进行放大。
V ysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。
FISH检测对被测样本没有特殊的要求。
可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。
甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。
获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。
我们以V ysis公司的AneuV ysion多色DNA探针试剂盒为例，简要介绍FISH的原位杂交过程。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
荧光原位杂交技术（FISH）常见问答对于FISH操作来说，那些因素比较重要？在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。
在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果？发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。
在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。
此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。
因此保证FISH操作中的温度非常重要。
该如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。
如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内）。
其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH 操作尤为重要。
此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。
同时检测的样本最好不能超过4块。
操作中的行动一定要迅速。
操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。
特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。
因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。
使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。
但随后信号急剧衰减。
几分钟后信号就消失了。
这是探针本身的质量问题吗？在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。
出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。
阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。
因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作。
也可以在封片观察时加入一定的antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。
如何配制各种试剂呢？强烈建议使用去离子水配制各种所需的试剂。
此外，配制后使用pH计检测是否符合要求。
配制的各种试剂都要采用超纯级的要求。
每次FISH使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。
洗脱液和变性液当天用当天配。
直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。
与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。
随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。
因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。
我能对同一样本进行多次的FISH操作吗？在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。
如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。
针对不同的样本，处理方法略有不同。
外周血样本的处理：1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片2、将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。
将片子风干后就可以进行重复的杂交了。
二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。
如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。
对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。
曾有报道在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作。
也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作：将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。
将片子风干后就可以进行重复的杂交了。
二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。
如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。
H&E 去染色由于H&E染色使样本片在荧光显微镜下出现类似自发的荧光，因此有必要洗去H&E染色。
以下的步骤并不能洗去100％的H&E，但对于大多数的H&E样本片，建议进行以下操作。
1、揭去盖玻片，置于65ºC的预处理液中孵育45分钟。
残余的可见染料可在随后的去石蜡操作中被除去2、进行标准的去石蜡预处理操作当将0.1% NP-40的洗液加热时出现混浊，是否正常？加热时洗液出现混浊是正常的，并不会干扰FISH的结果。
复合荧光原位杂交和光谱核型分析进展徐岚陈赛娟用染色体核型分析进行细胞遗传学检查，因其实用性和准确性，很快成为染色体异常的常规筛选检查。
但是由于核型分析并不能完全适应复杂核型分析的需要，特别对于一些实体瘤组织，不仅染色体改变复杂，而且难以制备有一定质量的中期染色体分裂相，因此，更难以用传统核型分析得到准确结果。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)由于其高度敏感性和特异性，已成为另一有力的细胞遗传学研究工具，并与核型分析互相补充联合应用［1］。
在此基础上，随着探针制备的完善与发展，进一步衍生出染色体涂抹(chromosome painting,CP)［2］，比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)［3］及反向染色体涂抹(reverse CP,RCP)等［4］。
这些技术的联合应用，丰富了细胞遗传学研究内容，使细胞遗传学向分子领域发展，并在临床和科研工作中得到广泛应用。
但是FISH也有其局限性，首先它只能用特异性的探针检测已知的染色体异常；其次，能够同时检测的目标数受限于探针数，也就是荧光显微镜所能分辨的荧光素的数目［5］。
因此，FISH不能作为染色体异常的筛选实验。
1990年，Nederlof等［6］描述了一种方法，仅用3种荧光素标记了7种探针(表1)，这种方法称为联合标记(combinatorial labeling)。
1992年，David Ward等［7］再次用3种荧光素同时检测了7个DNA探针，证实了其可行性。
于是，科学家们设想给人类22条常染色体和2条性染色体染上不同的颜色，可以在一份标本上同时看到24种颜色显示出所有染色体。
但是由于技术与设备等原因，直到1996年Speicher等［8］在一次对分裂中期染色体的分析中，同时以24种颜色显示出所有染色体。
这种细胞遗传学方法被称为复合FISH(multiplex FISH,mFISH)。
表1 mFISH联合标记方法1 mFISH基本原理和方法将一个人类染色体探针池分别标记上24种不同的荧光素组合，然后与中期染色体分裂相进行杂交，经电荷耦联装置(charge-coupled device,CCD)显微镜摄像，计算机处理产生24色人类染色体图像。
mFISH的成功依赖于24色探针标记，滤片装置的选择及计算机软件的发展［5］。
1.1 探针标记和荧光选择mFISH的DNA探针是由显微切割产生、并经PCR扩增的全染色体探针［9］，经缺口平移法进行联合标记。
联合标记的出现，使N个荧光素可标记远远多于该数目的探针。
如，2种荧光素可标记3种探针，3种荧光素可标记7种探针，那么N种荧光素可组成的有效组合是2N-1，5种荧光素即能产生31种组合，已满足了检测24种染色体的需要。
这5种荧光素包括：异氰酸荧光素(FITC)、花氰染色(Cy)3、Cy3.5、Cy5和Cy7，同时用于标记24种染色体(表2)。
在联合标记中，一条染色体或者100%用某种荧光素标记，或者没有用这种荧光素标记。
而在另一种新的标记技术——比例标记(ratio labeling)中［10］，通过变换荧光素比例(0～100%)达到标记的目的。
如仅使用2种荧光素FITC和德克萨斯红(Texas red)能标记5条染色体，显示出5种颜色(表3)。
与联合标记相比，比例标记可以用更少的荧光素得到更多的组合，标记更多的探针，联合标记与比例标记的共同使用，将进一步完善mFISH标记技术［11］，获得更广的应用范围。
1.2 滤片选择滤片选择每个荧光素与其波长最接近的2个荧光素的激发/发散比值比＞90%［5，8］。
如，Cy5与Cy5.5的激发/发散比值比为80%～90%，而其他荧光素的比值比均大于90%，因此，Cy5.5不适用于mFISH。
此外，滤片的带宽被限制在5～15 nm范围内，而其他标准滤片的带宽约为50 nm或更宽［8］。
1.3 电脑图像处理mFISH的图像处理是另一关键步骤。
mFISH图像处理软件系统首先纠正由干扰产生的几何图像的移位；根据4，6-二脒-2-苯吲哚(4，6-diamino-2-phenyliodole dihydrochloride,DAPI)染色分辨出一个中期分裂相中所有染色体；计算每种荧光的背景强度阈值；建立每个探针的光谱信号，然后通过识别与探针杂交物质来鉴定染色体，产生复合的灰值图像，每对染色体分别由1种灰值编码，最后给每种灰值一种伪彩色，并显示出结果［12］。
表2 5种荧光素联合标记人类24条染色体表3 mFISH按比例标记方法简而言之，Speicher的方法是通过转换滤片来捕获每个荧光素的单独图像，然后用CCD摄象系统和电脑处理软件叠加每条染色体上的荧光，产生至少24种的伪彩色。
同年，Schrock［13］用另一种技术——光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)同样进行了24种彩色染色体的分析。
两者相比，基于滤片摄取原理的mFISH允许使用更广范围的荧光素，产生更少的原始数据，更易进行结果处理。
2 应用2.1 染色体核型分析常规染色体核型分析不仅需要高强度劳动力，而且还依赖于个人技术，不能进行完全自动化分析［5］。
常规FISH也有其限制性，而mFISH 能有效弥补两者的缺陷。
与FISH相比，mFISH能在一次杂交实验中筛查所有染色体，并不需要预先知道其核型异常。
由于它是通过多次杂交实验找到每条染色体探针的最佳荧光位置，一旦探针构成参数建立了，那么每次杂交的变异就很小，因此可以获得高度的重复性［12］。
mFISH能对中期染色体分裂相进行快速分析，即使有很复杂的大量染色体的重排，也能很快分析出；特别对一些未知来源的标记染色体，能很快根据颜色确定其来源；mFISH更能提供全自动核型分析［15］，既克服了常规核型分析的缺点，又具有部分FISH的优点，有其独特的应用价值。
mFISH用于染色体核型分析，可以鉴定数目异常，一些结构重排，例如简单和复杂结构易位，比较大的重复和缺失及一些臂间倒位也能简单鉴定出，重要的是mFISH相对于核型分析来说是全自动，节省了劳力与时间［15］。