荧光原位杂交 FISH 操作方法

荧光原位杂交（FISH）

1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)

（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；

（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；

（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；

（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。

2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）

（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；

（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；

（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；

（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。

3.透化与脱水（约1h）

现配proteinase k buffer：50mL

1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL

5M NaCl1mL10%SDS 2.5mL

dd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL

（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；

（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。

（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。

4.杂交（约2h）

（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；

（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度

5ng/μL）；

（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；

（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。

5.冲洗（约1h）

（1）杂交后，迅速（防止载玻片变冷）小心用预热的冲洗液冲洗载玻片1~2次；

（2）然后快速将载玻片放入48℃冲洗液中，在48℃放置20min；

（3）用灭菌水润洗载玻片3次，最后在空气中晾干。

6.镜检与拍照（约2h）

（1）晾干后，滴一滴抗荧光衰弱剂，小心盖上盖玻片，使样品被抗荧光衰弱剂覆盖，排除气泡，吸去多余液体，然后用指甲油封边。

（2）及时进行镜检，紫外易使荧光猝灭，应在同视野下最后观看。

（3）镜检后，样品可于-20℃暗处保存。

试剂配制与说明

（1）10×PBS：称取12.9g（Na2HPO4·12H2O）、2.2g（NaH2PO4·2H2O）、37.7g （NaCl）溶于500mL纯水中，高温高压灭菌保存。稀释至1×使用，pH7.2。（2）4%多聚甲醛：将44.5mL纯水加热到60℃，称取2g多聚甲醛加入其中，加2滴NaOH使其溶解，冷却至室温，加5mL10×PBS，以上均在通风橱中进行，用HCl调整pH到7.2，用0.22μm滤膜过滤，4℃避光保存。（3）盐酸乙醇溶液：1份浓盐酸和2份乙醇混合，清洗液，主要用于去除带颜色的有机染料。

（4）Poly-L-lysine溶液：Cat.NO.:E607015，规格为1mL，5mg/mL，可储存于-20℃保存12个月，取80μL加无菌水稀释50倍（0.1mg/L），分装储存于5mL离心管，-20℃保存。

（5）梯度乙醇：配制50%、80%、100%梯度乙醇，现配现用。

（6）探针：探针暗处用铝箔纸包裹放于冰上，12000r/min离心5min，加适量DEPC处理水，于暗处振荡5~10min溶解，吸取10μL，加DEPC水稀释

至100μL，分装于无菌EP管，每份10μL，包裹锡箔纸，-20℃保存。（7）5M NaCl：称取29gNaCl分多次溶于约90mL水中，等待完全溶解，高温高压灭菌。

（8）1M Tris/HCl：称取12.11g Tris溶于80mL水中，溶解后用浓盐酸调pH 至7.2，定容到100mL，高温高压灭菌。

（9）Formamide：通风橱内封装2mL甲酰胺，4℃保存。

（10）10%SDS：称取10g SDS于水中，静置放置，约20min后溶解，定容至100mL。

（11）0.5M EDTA：称取18.6g EDTA二钠溶于80mL水中，用NaOH颗粒调pH至7.2，定容到100mL，高温高压灭菌。

（12）20×SSC：称取17.52g NaCl、8.82g二水柠檬酸钠溶解于80mL纯水中，用NaOH调节pH至7.0，定容至100mL，过滤除菌。

（13）杂交缓冲液：

Stock reagent Volume final concentration

5M NaCl360μL900mM

1M Tris/HCl40μL20mM Formamide%depending on probe

distilled H2O add to2mL

10%SDS2μL0.01%

(add SDS last to avoid precipitation)

Considered Formamide：AOB,20%;PAO/GAO,35%.

（14）冲洗缓冲液：

Stock reagent Volume final concentration

5M NaCl concentration depending

on buffer(see table A in

appendix)%formamide in hybridization

1M Tris/HCl1mL20mM