饲料及畜产品中雌激素检测方法的研究进展_达剑森
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草业与畜牧 ２０１６ 年第 ３ 期 总第 ２２６ 期
CAOYE YU XUMU
畜牧科技
饲料及畜产品中雌激素检测方法的研究进展
达剑森 （江苏省扬州市邗江区畜牧兽医站， 江苏 扬州 225002）
摘要： 雌激素可干扰动物和人类正常的内分泌机能， 导致发育异常、 生殖功能障碍及癌症等， 现已证实的雌激素约有 80 余 种。 饲料及畜产品中雌激素残留对人类和动物的不良影响已引起全球的广泛关注， 建立简单快速有效的检测方法显得尤其重要， 因此， 本文介绍了雌激素的各种检测方法， 并对雌激素的检测方法进行了总结和展望。
放 射 免 疫 分 析 法 （Radioimmunoassay， RIA） 是 免疫分析加上放射性标记而创立的新的分析方法。
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草业与畜牧 ２０１６ 年第 ３ 期 总第 ２２６ 期
CAOYE YU XUMU
畜牧科技
Fra Baidu bibliotek
幕慧等 [17] 应用放射免疫法测定羊胎盘粉中 E2 含量， 加标平均回收率为 97.8％～106.3％。 虽然此法灵敏度 高 (最低检测限为 1.4pg/ml)， 特异性好， 操作简便迅 速， 但由于其放射性标记物半衰期较长， 具有少量 辐射， 对实验室有特殊要求并需要进行严格的放射 性废物处理， 对环境造成的危害较为严重， 因而逐 步被其他方法取代 [18]。 2.3 发光免疫分析法
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畜牧科技
CAOYE YU XUMU
２０１６ 年第 ３ 期 总第 ２２６ 期 草业与畜牧
道[9,10]， 鸡肉中己烯雌酚 （Diethylstilbestrol， DES） 的 最 低 检 测 限 为 2.0ng/ml， 加 标 回 收 率 为 78.07% ～ 88.46% ， 相 对 标 准 偏 差 为 0.99% ～8.36% 。 雌 二 醇 （Estradiol， E2） 最 低 检 测 限 为 310ng/ml， 加 标 回 收 率 71％～95％， 相对标准偏差为 5.6%～8.4%。 特别适 合于沸点高、 极性强、 热稳定性差的药物残留分析， 在环境和食品激素残留测定分析中应用广泛。 HPLC 与 GC 同 是 重 要 的 色 谱 分 析 手 段 ， HPLC 可 以 弥 补 GC 的不足之处， 可对 80%的有机化合物进行分析， 特别适用于衡量药物的检测， 因此两种方法各有千 秋、 互为补充。 1.3 超临界流体色谱联用技术
1.5 高效薄层色谱法 高 效 薄 层 色 谱 法 （High Performance Thin Layer
Chromatography， HPTLC） 与扫描技术结合， 多进行 半定量激素残留分析。 HPTLC 具有高分辨率、 高灵 敏度、 高通量等优点， 还具有很多其他色谱方法所 不具有的优点： 不存在色谱柱的中毒问题， 检测与 展开过程完全分开， 流动相对检测没有干扰， 在分 离后可采用最好的衍生方法， 得到最有利于检测的 样品， 目前最小检测量可达 1ng 的激素残留。 1.6 毛细管电泳分析法
高 效 液 相 色 谱 法 （ High performance liquid chromatography， HPLC） 是 20 世纪 60 年代末发展起 来的一种新技术， 是以液相溶剂作为流动相的色谱 技术， 具有无需衍生化、 可采用紫外检测或荧光检 测的特点， 并且荧光检测具有和质谱检测器相当的 高 灵 敏 度 （最 小 检 测 量 可 达 10pg）。 据 朱 小 红 等 报
气相色谱法 （Gas chromatography， GC） 是一种 以气体为流动相， 以固体吸附剂或涂有固体液的固 体载体为固定相的柱色谱分离技术， 是测定各种环 境和生物样品中雌激素的主要方法之一。 GC 具有效 能高、 灵敏度高、 选择性好、 分析速度快、 分离效 率高和应用范围广泛等优点， 最小检测量可以检测 到 10~12g 的物质。 但因检测前 样 品 需 要 经 过 萃 取 、 浓缩、 净化和衍生化等过程， 对仪器要求高而缩小 了其使用范围。 1.2 高效液相色谱法
近年来， 色谱－质谱联用法具有选择性强、 灵敏 度高、 定性定量能力强等特点， 是近年来药残分析发 展最快的手段之一。 这一方法主要包括液相色谱－质 谱联用 （LC-MS） 和气相色谱－质谱 联 用 （GC-MS） 等。 1.4.1 液相色谱－质谱联用法： LC-MS 法结合了 LC、 MS 的两者之长， 不仅具有灵敏度高、 重复性高、 选 择性好、 定性能力强、 分离效率高等优点， 而且能 适应雌激素种类繁多的需求， 最低检出限可达 0.003ng/ml [11]， 牛 肉 等 畜 产 品 样 品 中 加 标 回 收 率 是 76.8%~98.7% [12]。 但 其 仪 器 使 用 的 技 术 性 要 求 高 ， 测定样品的成本也较高， 仪器设备昂贵， 常规检测 中的样品前处理步骤繁琐费时， 不利于开展大规模 样品的检测。 1.4.2 气 相 色 谱－质 谱 联 用 法 ： GC-MS 法 具 有 灵 敏 度更高， 定量准确等优点， 可以在多种残留物同时 存在的情况下对其中的某种特定物质进行定量、 定 性检测。 但气质联用法要求目标物质沸点较低、 热 稳定好。 林维宣等 [13] 建立了动物组织中激素残留的 GC-MS 法检测方法， 检出限 1~5μg/kg， 平均回收率 为 59.1%~77.4%。
毛 细 管 电 泳 （Capillary electrophoresis， CE） 是 以毛细管为分离通道、 以电场为驱动力的新型液相 分离技术， 具有高灵敏度、 高分辨率、 高速度等特 点， 而且所需样品量少， 浓度可小至 10μg/ml， 分析 时间短， 只需少量缓冲液。 随着毛细管电泳技术的 不断发展， 逐渐出现非水毛细管阵列电泳、 毛细血 电泳免疫分析、 毛细管电色谱手性拆分等分支。 据 报道， 张敬敬等 [14] 运用该方法检测畜产品中激素残 留 ， 平 均 回 收 率 为 89.20%~95.34%， 检 测 限 为 4.5～ 5.5μg/ml。 2 免疫分析法
近年来出现的生物检测方法， 处理过程简单快 速， 如生物传感器法， 具有灵敏度高、 专一性强、 分析速度快和操作简便等特点。 3.1 体外实验 3.1.1 细 胞 培 养 ： 该 方 法 的 敏 感 性 高 ， 简 单 方 便 ， 应用广泛； 所用细胞来源于人， 排除了由动物实验 外推到人的不肯定性， 其结果能可靠地预测雌激素 对人体健康的影响； 可以检测多种雌激素。 但其缺 点也较多， 如细胞培养实验条件要求高， 培养基和 血清都有特殊要求， 成本较高； 不同细胞株对雌激 素的敏感性有较大差异， 且因培养条件、 所用血清 等的不同， 检测结果相差较大。 常用的敏感细胞株 有： T47D 细胞、 人乳腺癌细胞 MCF-7、 大鼠子宫原 代细胞、 大鼠垂体原代细胞等。 3.1.2 重组基因酵母实验 ： 重 组 基 因 酵 母 技 术 是 近 年来新研制的雌激素检测方法， 酵母细胞属于真核 细胞生物， 易培养， 对环境中的有害物质具有一定 的抵抗力。 研究者利用基因重组技术将构建成功的
收稿日期： 2016-01-08 作者简介： 达剑森 （1982- ）， 男， 江苏南通人， 兽 医 师 ， 博 士， 主要从事临床兽医学研究和动物性食品安全性评价。
要。 近几年来， 对于雌性激素残留的检测， 很多学 者做了大量深入的研究， 本文就雌性激素的化学分 析法、 免疫分析法及生物监测方法等方法进行综述， 以期建立和完善高灵敏度的雌激素类物质检测方法， 保障畜牧生产安全和食品安全， 保护动物及人类健 康。 1 化学分析法 1.1 气相色谱法
关键词： 雌激素； 检测方法； 研究进展
中图分类号： S81
文献标识码： A
DOI：10.3969/j.issn.1673-8403.2016.03.011
文章编号： 1673-8403（2016）03-0051-05
近年来， 随着人民生活水平的提高， 饮食中对 动物性蛋白的需求越来越大。 然而， 在经济利益的 驱使下， 有的养殖企业为了提高动物食品的产量， 降低生产的成本， 使用人工合成的雌激素类药物对 家畜进行育肥， 这些雌激素类药物滞留于动物性食 品中， 不但危害动物健康， 还可通过食物链进行富 集， 对人类健康形成长期危害， 导致人体的性激素 代谢紊乱 、 生殖器官异常 、 [1, 2] 生 殖 功 能 障 碍 [3] 及 胚胎发育异常 [4, 5] 等， 并影响神经系统和免疫系统， 甚至引发癌症， 这种危害有进一步扩大的趋势， 将 成为新世纪威胁动物和人类繁衍生息的潜在危险因 素之一 [6]。
免疫分析法 （Immuunoassay） 是以抗原-抗体特 异性结合反应为基础的检测方法， 以抗体为核心试 剂检测激素。 免疫分析法操作简便易行， 特异性强， 经济且灵敏度高。 常见的有酶联免疫分析法、 放射 免疫分析法以及发光免疫分析法等。 2.1 酶联免疫分析法
酶 联 免 疫 分 析 法 （ Enzyme -linked immunosor bentassay， ELISA）， 根据抗原-抗体反应动力学分类 法， 可以分为竞争性和非竞争性两种。 根据反应体系 与检测体系之间的关系分类， 又可分为直接法和间接 法， 间接法是检测抗体最常用的方法。 Feng 等 [15] 以 双酚 A (Bisphenol-A， BPA) 类似物为抗原， 建立了 BPA 的酶联免疫分析法， 检出限 0.27ng/ml， 因其高 通量性、 低试样量、 低成本等优点， 已显示出一定 的 应 用 前 景 。 据 李 瑞 园 等 [16] 报 道 ， 运 用 ELISA 对 饲料中 DES 进行定量测定， DES 在 0~4.5μg/kg 线性 关系良好， 样品加标平均回收率为 76%~94.2%， 且 适用于大批量样品的初筛。 2.2 放射免疫分析法
到目前为止， 雌激素类物质主要包括甾体激素 和非甾体类激素， 约有 80 余种化学物质 [7]。 饲料及 畜产品中的雌激素主要来源于天然雌激素、 植物性 雌激素 [8]、 真 菌 性 雌 激 素 、 人 工 合 成 的 雌 激 素 、 环 境化学污染物等。 雌激素含量微小， 但严重危害动 物及人类的健康和安全， 对它们的检测显得尤为重
人 雌 激 素 受 体 （Human estrogen receptor， HER） 酵 母 表 达 载 体 和 雌 激 素 效 应 元 件 （ Estrogen response elements， ERE） 调控的酵母报告基因 （β-半乳糖苷 酶的 Lac-Z 基因） 载体导入酵母细胞， 建 立 重 组 酵 母筛选系统， 利用转基因酵母菌株， 采用摇瓶法、 96 孔板法和单板法筛选雌激素。 由于酵母不含雌激 素受体 （Estrogen receptor， ER）， 克服了内源性 ER 的影响。 重组基因酵母法可将生物体内复杂的新陈 代谢和信号通路简化为受体配体反应过程， 使体外 检测更易操作。 达剑森等 [20] 建立的重组酵母测评体 系 ， 对 E2 的 检 测 灵 敏 度 达 到 了 10-12mol/L。 Coldham 等 [21] 应用重组基因酵母法 对 E2 检 测 灵 敏 度 进 行 了 评估， 证实该方法比人体乳腺癌细胞系 MCF-7 增殖 实验和子宫增重实验高 2~5 个数量级。 该方法不仅 灵敏度和特异性高， 而且方便快捷， 无同位素污染， 应用广泛 [22， 23]。 利用该方法可建立起筛选雌激素污 染物的高灵敏度的监测新技术以及环境安全的预警 体系。 3.1.3 DNA 阵列芯片筛选实验： DNA 阵列芯片也称 基因芯片， 通过在玻璃片上固定寡核苷酸阵列来研 究生物样品基因表达的芯片技术， 也称微阵列 （Microarray） 芯片。 该法不依赖其他生物体的作用， 而且具有高度平行性、 多样性、 微型化和自动化等 优点。 其不足在于非特异性背景结合量大， 干扰实 验结果。 3.2 体内实验 3.2.1 子 宫 生 长 试 验 ： 子 宫 生 长 试 验 （ Uterus growthtest） 是 最 早 建 立 的 检 测 雌 激 素 活 性 的 经 典 方 法。 其优点主要是作为整体实验， 可以检测某些需 要在体内代谢活化后才有活性的物质以及中间代谢 产物。 但不够灵敏， 影响因素较多， 动物实验结果 外推到人时有较大难度。 3.2.2 子宫血管渗透性 实 验 ： 小 鼠 经 过 双 侧 卵 巢 切 除 术 ， 恢 复 16～20d 后 ， 皮 下 注 射 不 同 浓 度 的 受 试 物。 注射后 3.5h 给动物静脉 注 射 125 I 标 记 的 人 血 清 白蛋白， 30min 后， 处死动物， 取血浆和子宫， 分别 测定二者的放射性， 以子宫组织放射活性与血浆的 放射活性之比来表示子宫血管对受试物的渗透性， 该渗透性大小与物质雌激素活性呈正比。
超临界流体色谱联用技术 （SFC） 是以超临界流 体为流动相的临界分离检测技术。 由于超临界流体 具有气体和液体的双重性质， 其黏度小、 传质阻力 小、 扩散速度快， 分离能力和速度可与 GC 相当。 同 时 ， 其 密 度 、 溶 解 力 和 速 度 又 与 HPLC 相 当 。 SFC 另一大特点是可以与大部分 GC 和 HPLC 的检测器相 连， 其应用范围以此得到极大的拓宽。 但由于其设 备昂贵， 限制了广泛应用。 1.4 色谱－质谱联用法
发光免疫技术 （FIA） 由计算机自动控制， 自动 化程度高， 避免了人为操作误差， 没有放射性污染， 但该方法仪器费用昂贵， 试剂成本高， 推广应用较 难。 2.4 荧光免疫分析法
荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一 种， 具有标记物稳定、 制备简单等特点， 用纳米粒 子作为标记物可显著提高该方法的灵敏度和分辨率， 且不影响生物大分子的活性。 Coons 等于 1941 年 首 次采用荧光素进行标记而获得成功。 钱建瑞等 [19] 建 立了检测雌三醇 （Estriol， E3） 的荧光免疫分析方法。 其线性范围为 0.01～1 000ng/ml， 检出限 0.0029ng/ml， 血 清 样 品 加 标 回 收 率 在 91%～117%之 间 。 但 因 为 一 般荧光测定中的本底较高等问题， 荧光免疫技术用 于定量测定存在一定的困难。 3 生物监测方法
CAOYE YU XUMU
畜牧科技
饲料及畜产品中雌激素检测方法的研究进展
达剑森 （江苏省扬州市邗江区畜牧兽医站， 江苏 扬州 225002）
摘要： 雌激素可干扰动物和人类正常的内分泌机能， 导致发育异常、 生殖功能障碍及癌症等， 现已证实的雌激素约有 80 余 种。 饲料及畜产品中雌激素残留对人类和动物的不良影响已引起全球的广泛关注， 建立简单快速有效的检测方法显得尤其重要， 因此， 本文介绍了雌激素的各种检测方法， 并对雌激素的检测方法进行了总结和展望。
放 射 免 疫 分 析 法 （Radioimmunoassay， RIA） 是 免疫分析加上放射性标记而创立的新的分析方法。
52
草业与畜牧 ２０１６ 年第 ３ 期 总第 ２２６ 期
CAOYE YU XUMU
畜牧科技
Fra Baidu bibliotek
幕慧等 [17] 应用放射免疫法测定羊胎盘粉中 E2 含量， 加标平均回收率为 97.8％～106.3％。 虽然此法灵敏度 高 (最低检测限为 1.4pg/ml)， 特异性好， 操作简便迅 速， 但由于其放射性标记物半衰期较长， 具有少量 辐射， 对实验室有特殊要求并需要进行严格的放射 性废物处理， 对环境造成的危害较为严重， 因而逐 步被其他方法取代 [18]。 2.3 发光免疫分析法
51
畜牧科技
CAOYE YU XUMU
２０１６ 年第 ３ 期 总第 ２２６ 期 草业与畜牧
道[9,10]， 鸡肉中己烯雌酚 （Diethylstilbestrol， DES） 的 最 低 检 测 限 为 2.0ng/ml， 加 标 回 收 率 为 78.07% ～ 88.46% ， 相 对 标 准 偏 差 为 0.99% ～8.36% 。 雌 二 醇 （Estradiol， E2） 最 低 检 测 限 为 310ng/ml， 加 标 回 收 率 71％～95％， 相对标准偏差为 5.6%～8.4%。 特别适 合于沸点高、 极性强、 热稳定性差的药物残留分析， 在环境和食品激素残留测定分析中应用广泛。 HPLC 与 GC 同 是 重 要 的 色 谱 分 析 手 段 ， HPLC 可 以 弥 补 GC 的不足之处， 可对 80%的有机化合物进行分析， 特别适用于衡量药物的检测， 因此两种方法各有千 秋、 互为补充。 1.3 超临界流体色谱联用技术
1.5 高效薄层色谱法 高 效 薄 层 色 谱 法 （High Performance Thin Layer
Chromatography， HPTLC） 与扫描技术结合， 多进行 半定量激素残留分析。 HPTLC 具有高分辨率、 高灵 敏度、 高通量等优点， 还具有很多其他色谱方法所 不具有的优点： 不存在色谱柱的中毒问题， 检测与 展开过程完全分开， 流动相对检测没有干扰， 在分 离后可采用最好的衍生方法， 得到最有利于检测的 样品， 目前最小检测量可达 1ng 的激素残留。 1.6 毛细管电泳分析法
高 效 液 相 色 谱 法 （ High performance liquid chromatography， HPLC） 是 20 世纪 60 年代末发展起 来的一种新技术， 是以液相溶剂作为流动相的色谱 技术， 具有无需衍生化、 可采用紫外检测或荧光检 测的特点， 并且荧光检测具有和质谱检测器相当的 高 灵 敏 度 （最 小 检 测 量 可 达 10pg）。 据 朱 小 红 等 报
气相色谱法 （Gas chromatography， GC） 是一种 以气体为流动相， 以固体吸附剂或涂有固体液的固 体载体为固定相的柱色谱分离技术， 是测定各种环 境和生物样品中雌激素的主要方法之一。 GC 具有效 能高、 灵敏度高、 选择性好、 分析速度快、 分离效 率高和应用范围广泛等优点， 最小检测量可以检测 到 10~12g 的物质。 但因检测前 样 品 需 要 经 过 萃 取 、 浓缩、 净化和衍生化等过程， 对仪器要求高而缩小 了其使用范围。 1.2 高效液相色谱法
近年来， 色谱－质谱联用法具有选择性强、 灵敏 度高、 定性定量能力强等特点， 是近年来药残分析发 展最快的手段之一。 这一方法主要包括液相色谱－质 谱联用 （LC-MS） 和气相色谱－质谱 联 用 （GC-MS） 等。 1.4.1 液相色谱－质谱联用法： LC-MS 法结合了 LC、 MS 的两者之长， 不仅具有灵敏度高、 重复性高、 选 择性好、 定性能力强、 分离效率高等优点， 而且能 适应雌激素种类繁多的需求， 最低检出限可达 0.003ng/ml [11]， 牛 肉 等 畜 产 品 样 品 中 加 标 回 收 率 是 76.8%~98.7% [12]。 但 其 仪 器 使 用 的 技 术 性 要 求 高 ， 测定样品的成本也较高， 仪器设备昂贵， 常规检测 中的样品前处理步骤繁琐费时， 不利于开展大规模 样品的检测。 1.4.2 气 相 色 谱－质 谱 联 用 法 ： GC-MS 法 具 有 灵 敏 度更高， 定量准确等优点， 可以在多种残留物同时 存在的情况下对其中的某种特定物质进行定量、 定 性检测。 但气质联用法要求目标物质沸点较低、 热 稳定好。 林维宣等 [13] 建立了动物组织中激素残留的 GC-MS 法检测方法， 检出限 1~5μg/kg， 平均回收率 为 59.1%~77.4%。
毛 细 管 电 泳 （Capillary electrophoresis， CE） 是 以毛细管为分离通道、 以电场为驱动力的新型液相 分离技术， 具有高灵敏度、 高分辨率、 高速度等特 点， 而且所需样品量少， 浓度可小至 10μg/ml， 分析 时间短， 只需少量缓冲液。 随着毛细管电泳技术的 不断发展， 逐渐出现非水毛细管阵列电泳、 毛细血 电泳免疫分析、 毛细管电色谱手性拆分等分支。 据 报道， 张敬敬等 [14] 运用该方法检测畜产品中激素残 留 ， 平 均 回 收 率 为 89.20%~95.34%， 检 测 限 为 4.5～ 5.5μg/ml。 2 免疫分析法
近年来出现的生物检测方法， 处理过程简单快 速， 如生物传感器法， 具有灵敏度高、 专一性强、 分析速度快和操作简便等特点。 3.1 体外实验 3.1.1 细 胞 培 养 ： 该 方 法 的 敏 感 性 高 ， 简 单 方 便 ， 应用广泛； 所用细胞来源于人， 排除了由动物实验 外推到人的不肯定性， 其结果能可靠地预测雌激素 对人体健康的影响； 可以检测多种雌激素。 但其缺 点也较多， 如细胞培养实验条件要求高， 培养基和 血清都有特殊要求， 成本较高； 不同细胞株对雌激 素的敏感性有较大差异， 且因培养条件、 所用血清 等的不同， 检测结果相差较大。 常用的敏感细胞株 有： T47D 细胞、 人乳腺癌细胞 MCF-7、 大鼠子宫原 代细胞、 大鼠垂体原代细胞等。 3.1.2 重组基因酵母实验 ： 重 组 基 因 酵 母 技 术 是 近 年来新研制的雌激素检测方法， 酵母细胞属于真核 细胞生物， 易培养， 对环境中的有害物质具有一定 的抵抗力。 研究者利用基因重组技术将构建成功的
收稿日期： 2016-01-08 作者简介： 达剑森 （1982- ）， 男， 江苏南通人， 兽 医 师 ， 博 士， 主要从事临床兽医学研究和动物性食品安全性评价。
要。 近几年来， 对于雌性激素残留的检测， 很多学 者做了大量深入的研究， 本文就雌性激素的化学分 析法、 免疫分析法及生物监测方法等方法进行综述， 以期建立和完善高灵敏度的雌激素类物质检测方法， 保障畜牧生产安全和食品安全， 保护动物及人类健 康。 1 化学分析法 1.1 气相色谱法
关键词： 雌激素； 检测方法； 研究进展
中图分类号： S81
文献标识码： A
DOI：10.3969/j.issn.1673-8403.2016.03.011
文章编号： 1673-8403（2016）03-0051-05
近年来， 随着人民生活水平的提高， 饮食中对 动物性蛋白的需求越来越大。 然而， 在经济利益的 驱使下， 有的养殖企业为了提高动物食品的产量， 降低生产的成本， 使用人工合成的雌激素类药物对 家畜进行育肥， 这些雌激素类药物滞留于动物性食 品中， 不但危害动物健康， 还可通过食物链进行富 集， 对人类健康形成长期危害， 导致人体的性激素 代谢紊乱 、 生殖器官异常 、 [1, 2] 生 殖 功 能 障 碍 [3] 及 胚胎发育异常 [4, 5] 等， 并影响神经系统和免疫系统， 甚至引发癌症， 这种危害有进一步扩大的趋势， 将 成为新世纪威胁动物和人类繁衍生息的潜在危险因 素之一 [6]。
免疫分析法 （Immuunoassay） 是以抗原-抗体特 异性结合反应为基础的检测方法， 以抗体为核心试 剂检测激素。 免疫分析法操作简便易行， 特异性强， 经济且灵敏度高。 常见的有酶联免疫分析法、 放射 免疫分析法以及发光免疫分析法等。 2.1 酶联免疫分析法
酶 联 免 疫 分 析 法 （ Enzyme -linked immunosor bentassay， ELISA）， 根据抗原-抗体反应动力学分类 法， 可以分为竞争性和非竞争性两种。 根据反应体系 与检测体系之间的关系分类， 又可分为直接法和间接 法， 间接法是检测抗体最常用的方法。 Feng 等 [15] 以 双酚 A (Bisphenol-A， BPA) 类似物为抗原， 建立了 BPA 的酶联免疫分析法， 检出限 0.27ng/ml， 因其高 通量性、 低试样量、 低成本等优点， 已显示出一定 的 应 用 前 景 。 据 李 瑞 园 等 [16] 报 道 ， 运 用 ELISA 对 饲料中 DES 进行定量测定， DES 在 0~4.5μg/kg 线性 关系良好， 样品加标平均回收率为 76%~94.2%， 且 适用于大批量样品的初筛。 2.2 放射免疫分析法
到目前为止， 雌激素类物质主要包括甾体激素 和非甾体类激素， 约有 80 余种化学物质 [7]。 饲料及 畜产品中的雌激素主要来源于天然雌激素、 植物性 雌激素 [8]、 真 菌 性 雌 激 素 、 人 工 合 成 的 雌 激 素 、 环 境化学污染物等。 雌激素含量微小， 但严重危害动 物及人类的健康和安全， 对它们的检测显得尤为重
人 雌 激 素 受 体 （Human estrogen receptor， HER） 酵 母 表 达 载 体 和 雌 激 素 效 应 元 件 （ Estrogen response elements， ERE） 调控的酵母报告基因 （β-半乳糖苷 酶的 Lac-Z 基因） 载体导入酵母细胞， 建 立 重 组 酵 母筛选系统， 利用转基因酵母菌株， 采用摇瓶法、 96 孔板法和单板法筛选雌激素。 由于酵母不含雌激 素受体 （Estrogen receptor， ER）， 克服了内源性 ER 的影响。 重组基因酵母法可将生物体内复杂的新陈 代谢和信号通路简化为受体配体反应过程， 使体外 检测更易操作。 达剑森等 [20] 建立的重组酵母测评体 系 ， 对 E2 的 检 测 灵 敏 度 达 到 了 10-12mol/L。 Coldham 等 [21] 应用重组基因酵母法 对 E2 检 测 灵 敏 度 进 行 了 评估， 证实该方法比人体乳腺癌细胞系 MCF-7 增殖 实验和子宫增重实验高 2~5 个数量级。 该方法不仅 灵敏度和特异性高， 而且方便快捷， 无同位素污染， 应用广泛 [22， 23]。 利用该方法可建立起筛选雌激素污 染物的高灵敏度的监测新技术以及环境安全的预警 体系。 3.1.3 DNA 阵列芯片筛选实验： DNA 阵列芯片也称 基因芯片， 通过在玻璃片上固定寡核苷酸阵列来研 究生物样品基因表达的芯片技术， 也称微阵列 （Microarray） 芯片。 该法不依赖其他生物体的作用， 而且具有高度平行性、 多样性、 微型化和自动化等 优点。 其不足在于非特异性背景结合量大， 干扰实 验结果。 3.2 体内实验 3.2.1 子 宫 生 长 试 验 ： 子 宫 生 长 试 验 （ Uterus growthtest） 是 最 早 建 立 的 检 测 雌 激 素 活 性 的 经 典 方 法。 其优点主要是作为整体实验， 可以检测某些需 要在体内代谢活化后才有活性的物质以及中间代谢 产物。 但不够灵敏， 影响因素较多， 动物实验结果 外推到人时有较大难度。 3.2.2 子宫血管渗透性 实 验 ： 小 鼠 经 过 双 侧 卵 巢 切 除 术 ， 恢 复 16～20d 后 ， 皮 下 注 射 不 同 浓 度 的 受 试 物。 注射后 3.5h 给动物静脉 注 射 125 I 标 记 的 人 血 清 白蛋白， 30min 后， 处死动物， 取血浆和子宫， 分别 测定二者的放射性， 以子宫组织放射活性与血浆的 放射活性之比来表示子宫血管对受试物的渗透性， 该渗透性大小与物质雌激素活性呈正比。
超临界流体色谱联用技术 （SFC） 是以超临界流 体为流动相的临界分离检测技术。 由于超临界流体 具有气体和液体的双重性质， 其黏度小、 传质阻力 小、 扩散速度快， 分离能力和速度可与 GC 相当。 同 时 ， 其 密 度 、 溶 解 力 和 速 度 又 与 HPLC 相 当 。 SFC 另一大特点是可以与大部分 GC 和 HPLC 的检测器相 连， 其应用范围以此得到极大的拓宽。 但由于其设 备昂贵， 限制了广泛应用。 1.4 色谱－质谱联用法
发光免疫技术 （FIA） 由计算机自动控制， 自动 化程度高， 避免了人为操作误差， 没有放射性污染， 但该方法仪器费用昂贵， 试剂成本高， 推广应用较 难。 2.4 荧光免疫分析法
荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一 种， 具有标记物稳定、 制备简单等特点， 用纳米粒 子作为标记物可显著提高该方法的灵敏度和分辨率， 且不影响生物大分子的活性。 Coons 等于 1941 年 首 次采用荧光素进行标记而获得成功。 钱建瑞等 [19] 建 立了检测雌三醇 （Estriol， E3） 的荧光免疫分析方法。 其线性范围为 0.01～1 000ng/ml， 检出限 0.0029ng/ml， 血 清 样 品 加 标 回 收 率 在 91%～117%之 间 。 但 因 为 一 般荧光测定中的本底较高等问题， 荧光免疫技术用 于定量测定存在一定的困难。 3 生物监测方法