革兰氏染色和抗酸染色法

细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为G+菌； 细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色 （红色）的细菌为G-菌。
G+
G-
二、实验器材
大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革 兰氏染色液，生理盐水，载玻片，接 种环，显微镜等。
三、操作步骤
1、涂片：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别 涂片、干燥、固定。 2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分 钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一 分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用 95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约20—30秒，立 即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1--2分钟，水洗 3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细 菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性 菌呈红色。
当用脱色剂处理时，G+菌的细胞壁主要由肽聚 糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低， 用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结 构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复 合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染 后仍保留初染剂的蓝紫色。 G-菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂 质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶 解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比 较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染 上复染剂的红色。


（4）用3%盐酸酒精脱色，直到流下的脱色剂无色为
止，水洗。 （5）用碱性美蓝染液复染30秒，水洗、干燥、镜检。
【结果观察】 1.结核杆菌染成红色，细长，直的或为微 弯曲，有的可表现出分枝特征，偶而有着 色不匀，成颗粒状者。亦可以见到有纵行 条索状排列。标本的其余部分及非抗酸性 细菌染成蓝色。必须逐一观察各个视野， 直待全部涂片找不到结核杆菌时，才可报 告阴性。
2.涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要
每ml痰液内含菌量至少应有500个以上， 甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集 菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染 色标本片观察中，不一定每个视野都能看 到结核杆菌。
3.结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临
床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断 裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、 球状颗粒，亦称Much颗粒。 4.标本经高压灭菌处理，不影响染色结果， 也保证操作者的安全。
一、实验原理
（一）基本步骤：
1、初染：草酸胺结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：石炭酸复红复染
（二）原理：
细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它 们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝 紫色。 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结 晶紫—碘的复合物，增强染料与细菌的 结合力。
五、革兰染色的临床意义
1.对细菌的鉴别有重要意义 2.指导临床选择用药 3.研究细菌与致病性的关系
思考题： 怎样能确证你的染色技术操作正确，
结果可靠？
当你对一株未知菌进行革兰染色时，
抗酸染色法
【原理】
结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或
延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒
【方法】
1．涂膜
痰的涂片：用灭菌的接种环采取痰中干酪
坏死的小块或带血的痰液，在载玻片上涂
成薄而均匀的膜（在烧接种环时为防止痰
中的细菌溅出，可先将接种环在内焰烧干，
然后再于外焰中灭菌）。
2．染色
（1）在已固定好的涂片上放置滤纸片（滤纸的作用是 滤去染液中的沉渣，使标本清晰），滴加石炭酸变红染色 液于滤纸片上（应滴满滤纸片）。 （2）将加有染液的涂片加温，在火焰上保持一定的高 度，直到出现蒸汽（不得沸腾）如此反复2—3次（约5分 钟）。在加温过程中防止将染液烘干（应及时添加染液）。 （3）去掉滤纸片，使涂片冷却，水洗。
四、注意事项
1、注意涂片不宜过于浓厚。 2、火焰固定温度要适宜。 3、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳 性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多 少等因素的影响，难以严格规定。 4、染色过程中应吸去玻片上的残水，以免染色 液被稀释而影响染色效果。 5、选择幼龄的细菌。G+菌培养12-16h，E.coli 培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使 G+菌转呈阴性反应。
微生物学两大经典染色： 革兰氏染色法 抗酸染色法
革兰染色法
革兰氏染色法是1884年由丹麦病 理学家汉斯· 克里斯蒂安· 革兰 （Hans Christain Gran ）创立的。
实验目的和要求
1. 掌握革兰氏染色方法的操作步骤及 注意事项。 2. 了解革兰氏染色的临床意义。
一、实验原理 二、实验器材 三、操作步骤 四、注意事项 五、革兰染色的临床意义
Baidu Nhomakorabea
精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核
杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸
菌和细胞杂质等呈蓝色。
【材料】
①结核病人的咳痰液：采取清晨第一口粘 痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。 ②石炭酸复红染色液，3%盐酸酒精，碱性 美蓝染液 ③生理盐水
④载物玻片，滤纸片、接种环、玻片夹、 酒精灯、蜡笔等