抗酸染色——标准操作
抗酸染色镜检的操作规程
抗酸染色镜检的操作规程1.目的:通过抗酸染色鉴别结核杆菌.2.原理:一般认为抗酸性菌体内含脂类物质较多,此物质具有抗酸的性质.染色时,它与石碳酸复红结合牢固,能抵抗酸性酒精的脱色作用,同时脂类又不易透过细胞膜,不能被脱色,因此抗酸菌能保持复红的颜色.相反,非抗酸性菌体内含脂类少,易被酸性酒精脱色,脱色时又易从细胞膜渗出而脱掉,最后被复染蓝色.3.试剂:3.1试剂来源:购买珠海贝索3.2试剂盒组成:R1:石碳酸复红溶液1χ100ml R2:酸性酒精溶液1χ100mlR3:亚甲基蓝溶液1χ100ml4.质量控制:室内质控包括痰标本收集,痰片染色和镜检结果复查.痰涂片应保存供上一级参比实验室质量控制检查.5.标本采集与处理:5.1病人留标本前用清水漱口,用力咳出来自支气管深部的脓样或粘液样痰,量不少于3ml避免留唾液或鼻咽部分泌物.5.2夜间痰为就诊前一天晚睡前咳出的痰液.5.3初诊病人应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰),痰液不合格者重送.5.4涂片:取脱脂过的干燥、清洁、无油污的新玻片，在玻片背面的左端1/3处以记号笔编号,用折断的竹签挑取痰标本的脓样,干酪样0.1ML,于玻片上均匀涂抹成2ⅹ2.5CM卵圆形痰膜,自然干燥后待检.6.染色方法:6.1用片夹夹住涂片火焰固定,加石碳酸复红溶液,徐徐加热至有蒸汽出现染5分钟,水洗.6.2加脱色剂,不时摇动玻片至无色脱落为止,水洗.6.3加复染液,染0.5-1分钟,水洗涂片后镜检.滴1-2滴香柏油,用油镜仔细观察.8.结果的判断:结核杆菌呈红色,其它细菌呈蓝色.9.实验完后的处理:9.1先用擦镜纸将镜头上的油擦去,再用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次,最后用干净擦镜纸擦2-3次,向一个方向擦拭。
9.2废弃玻片放入5% 84消毒液中浸泡60分钟,消毒液要每天更换。
9.3痰盒和废弃标本等污染物应弃于有盖的污物桶内,消毒后焚烧。
9.4痰检完成后,操作台面用5% 84消毒剂 液擦拭后,紫外线灭菌灯照射30分钟。
抗酸染色操作步骤考核评分标准
冲洗未先平放扣2分，冲洗未从一端冲洗扣2分
脱色
1.3%盐酸酒精脱色30秒--1分钟；2.用水冲洗（流水自玻片一端轻缓冲洗，沥去玻片上剩余的水）。
（20分）
20分
未按标准步骤完成每步扣10分。酒精脱色未完全（痰膜无可视红色为止）扣2分。
复染
用亚甲兰溶液，复染30秒--1分钟，水洗，待自然干燥后用油镜观察。
2.滴加石碳酸复红2-3滴，覆盖整个标本
3.在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟.
4.待标本冷却后用水冲洗，（流水自玻片一端轻缓冲洗，沥去玻片上剩余的水）
（40分）
40分
未按标准完成每步扣10分。石碳酸复红未覆盖整个玻片标本扣2分
加热出现沸腾扣2分
抗酸染色操作步骤考核评分标准
被考核人：得分：
步骤
操作程序
分值
评分方法
缺陷及扣分
细菌图片的
制备
1涂片：用竹签挑取可疑部分标本0.05ml，涂10-20mm的卵圆形痰膜。
2干燥：自然干燥或染色前加热固定。
3固定：火焰Leabharlann 定（30分）30分
每骤10分，缺一步扣10分。痰膜过宽或过窄扣2分
初染
1.用玻片夹夹持涂片标本.
（10分）
10分
完成不规范每步扣5分，扣完为止。有红色斑块，未达到痰膜肉眼观为亮蓝色，扣2分。
合计
考核时间：2014年7月日监考人：
微生物抗酸染色步骤
微生物抗酸染色步骤如下：
1. 准备试剂：选择合适的载玻片，用9%的冰醋酸溶液浸湿载玻片。
用无菌操作取瑞氏染液、美蓝染液、无菌生理盐水，分别滴加到染色槽中，确保每个槽中液体的高度占据染色槽的2/3。
2. 涂片：采取标本时，应使用无菌操作取少量标本放入无菌离心管中，加入少量的无菌生理盐水，振荡离心管使标本充分溶解。
用吸管吸取少量的溶解标本均匀涂布在载玻片上，注意应避免标本在载玻片上形成气泡。
3. 抗酸染色：用竹镊子将涂有标本的载玻片拿起来，先加入少量美蓝染液，盖上盖玻片，避免染液进入对下步观察产生干扰。
用同样方法加等量无菌生理盐水洗去染液后，再滴加少量瑞氏染液，迅速用滤纸吸去多余染液。
4. 镜检观察：染色后，待染色液稍干后，用显微镜观察染色情况。
如果是抗酸阳性杆菌，则会被染成蓝色或淡蓝色；而其他革兰阴性杆菌则会被染成红色。
微生物抗酸染色主要用于区分抗酸杆菌和其他革兰阴性杆菌，尤其是在结核病诊断和疫情监测中具有重要意义。
不同微生物的抗酸染色结果可能会因为菌种的差异而略有差异。
具体操作时应注意无菌操作和染液的配制方法，以及涂片、染色和观察的技巧。
以上内容仅供参考，建议到正规医疗机构进行咨询，获取更全面和准确的信息。
实验九抗酸染色.ppt.ppt
二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影 响
(1)交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交 流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快 生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。
(2)通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得 快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社 会生活。
1．李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，“前10年盈和，成
为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立
之势”。这说明该企业的创办
()
A．打破了外商对中国航运业的垄断
B．阻止了外国对中国的经济侵略
C．标志着中国近代化的起步
D．使李鸿章转变为民族资本家
解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家； 洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业 的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵 制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D 三项表述都有错误。 答案：A
出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事
业是
()
A．电报业
B．大众报业
C．铁路交通业 D．轮船航运业
[解析] 材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。
[答案] A
[题组冲关]
3．假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信
息，可采用的最快捷的方式是
()
A．乘坐飞机赴各地了解 B．通过无线电报输送讯息
时
代潮流
图说历史
主旨句归纳
(1)20世纪初，孙中山提出“民族、民权、
民生”三民主义，成为以后辛亥革命
的
指导思想。
(2)三民主义没有明确提出反帝要求，也
革兰染色与抗酸染色操作规范
一、实验原理G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。
G－菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄或稀释石碳酸复红复染后呈红色。
二、实验器材【载玻片、试管架、红蓝铅笔、接种环、记号笔、酒精灯、打火机、生理盐水、吸水纸、冲洗瓶】、钟表、显微镜、香柏油、擦镜纸、染色盘、染色架、消毒洗手液等。
三、实验试剂革兰染液：草酸铵结晶紫染液、碘液、脱色液（95%乙醇）、蕃红复染液。
四、实验标本痰液五、操作步骤1.标记选择玻片并正确编号（标本号）2.涂片用灭菌接种环挑取菌落与载玻片上预先滴加的生理盐水涂布成1cm2或蚕豆大小的半透明菌膜。
3.干燥涂片制成后，在空气中使其迅速干燥，以免菌体皱缩变形（若需加快干燥速度，将涂布面朝上，置于火焰上方，不烫手的位置，慢慢烘干，切勿紧贴火焰）。
4.固定玻片干燥后火焰加热法固定，即玻片（菌膜面向上）中速从火焰上端通过3次进行固定，以玻片反面接触手背皮肤，热而不烫为宜。
5.初染加结晶紫染液染60s，细流水冲洗，并倒去玻片上积水。
6.媒染加碘液染60s，细流水冲洗。
7.脱色加脱色液，不时摇动10s~30s，至无紫色逸出为止，细流水冲洗。
8.复染加复染液，染30s~60s，细流水冲洗。
9.镜检待已染色的细菌标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，再用显微镜进行观察，先用低倍镜观察，再滴加一滴香柏油用油镜观察。
注意：染色时间不同试剂有所不同。
六、结果观察1、紫色：G+2、红色：G-一、实验原理：分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。
抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
抗酸染色液(Ziehl-Neelsen热染法)
染色结果：
抗酸菌
红色
背景及非抗酸菌
蓝色Leabharlann 注意事项：1、 每次使用后盖紧试剂瓶，以防试剂挥发和污染。 2、 上述试剂均对人体有刺激性，请注意适当防护。
操作步骤(仅供参考)：
1、 接种环挑取待检样本，涂布于载玱片上，涂片加热固定。 2、 滴加 Ziehl－Neelsen 复红染色液，用火焰微热至出现蒸汽，一般该染色过程至少。 3、 蒸馏水冲洗。 4、 用 Ziehl－Neelsen 脱色液脱色至无红色为止。 5、 蒸馏水冲洗。 6、 用亚甲蓝染色液染色。 7、 蒸馏水冲洗。 8、 轻轻吸干水分，自然干燥。 9、 油镜镜检。
北京雷根生物技术有限公司
抗酸染色液(Ziehl-Neelsen 热染法)
简介：
分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂质包围在肽聚糖的外面, 所以分枝杆菌一般丌易着色。 分枝杆菌中的分枝菌酸不染料一旦结合后，就很难被酸性脱色液脱色，故名抗酸染色。抗 酸染色液(Ziehl－Neelsen 热染法)属于热染色液，其染色原理是在加热条件下，分枝菌酸 不复红结合成复合物，经亚甲蓝复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物 质为蓝色。该试剂盒更适用于冷染法效果丌佳的情况。
组成：
编号 名称 试剂(A): Ziehl－Neelsen 复红染色液 试剂(B): Ziehl－Neelsen 脱色液 试剂(C): 亚甲蓝染色液 使用说明书
DM0034 3×50ml
50ml 50ml 50ml
DM0034 3×100ml
100ml 100ml 100ml
1份
Storage
RT 避光 RT RT 避光
抗酸染色实验报告讨论
抗酸染色实验报告讨论一、实验目的本实验旨在掌握抗酸染色技术，了解其原理和应用，并通过实验操作，掌握抗酸染色技术的步骤和注意事项。
二、实验原理抗酸染色是一种常用的细胞学染色方法，它可以对细胞核进行染色。
抗酸染色的原理是利用甲苯胺蓝等碱性颜料在强酸条件下与DNA结合，形成紫色或蓝紫色颜料复合物。
这种复合物可以被观察者通过显微镜观察到，从而达到对细胞核的染色目的。
三、实验步骤1. 取一片已经制片好的标本切片，用甲醛固定5-10分钟；2. 用流动自来水洗涤3次，每次洗涤1分钟；3. 用生理盐水洗涤3次，每次洗涤1分钟；4. 滴加甲苯胺蓝溶液覆盖标本切片并静置5-10分钟；5. 用生理盐水洗涤3次，每次洗涤1分钟；6. 用95%乙醇固定染色，每次固定1-2分钟；7. 用绝对乙醇清洗3次，每次清洗1-2分钟；8. 用苯胺油清洗3次，每次清洗1-2分钟；9. 用封片剂将标本切片封装。
四、实验注意事项1. 实验室操作时应佩戴手套、口罩和护目镜等防护设备；2. 实验中使用的甲苯胺蓝溶液应保持干燥和避光保存；3. 切片操作时应注意不要过度刮伤标本组织，并确保标本组织完整；4. 染色操作时应注意控制染色时间和温度，避免过度染色或染色不均匀。
五、实验结果通过抗酸染色技术，可以明显地观察到标本切片中的细胞核。
在显微镜下观察到的细胞核呈现出紫色或蓝紫色，并且具有明显的形态特征。
通过对比不同样品的细胞核形态和数量，可以得出不同样品之间的差异和相似之处。
六、实验分析抗酸染色技术是一种常用的细胞学染色方法，它可以对细胞核进行染色，并且具有简单、快速、准确等特点。
抗酸染色技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
在实验操作过程中，需要注意控制好染色时间和温度，避免过度染色或染色不均匀。
此外，在切片操作时也需要注意不要过度刮伤标本组织，并确保标本组织完整。
七、实验结论通过本次实验，我们掌握了抗酸染色技术的步骤和注意事项，并通过实验操作了解了抗酸染色技术的原理和应用。
抗酸染色的操作及临床应用
抗酸染色的操作及临床应用抗酸染色是一种在临床病理学中常用的技术，用于检测和诊断与酸性染料亲和的微生物，特别是结核分枝杆菌。
这种染色方法被广泛应用于结核病的确诊、治疗监测及相关疾病的鉴别诊断。
下面将详细介绍抗酸染色的操作及临床应用。
操作方法：1. 原料准备：准备好益氏染液、酸酒红溶液、高锰酸钾溶液、酸性酮液、甲苯、绝对醇和脱脂溶剂等试剂和溶液。
2. 标本制备：将待检标本如痰液、尿液、刮片等经过前处理（如离心、加热、电洗等）后涂片制备，并将涂片固定在90摄氏度的焙烧烘箱中固定片上3~5秒钟，然后用冷水洗净。
3. 染色操作：将固定的检测标本涂片用甲苯浸泡2~5分钟，将甲苯吸出后加入酒精脱脂2~5分钟，然后再用绝对醇脱脂2~5分钟，最后用脱脂溶剂脱脂30~120秒。
4. 抗酸染色：将脱脂后的标本涂片完全浸入益氏染液中，保持液面在标本上1~2毫米高，将益氏染液再加热到80摄氏度，静置5~10分钟，待酸性酮为蓝色。
5. 染色反应：用高锰酸钾溶液滴落在标本上，加热到细菌虫红颜色被去掉，再滴落高锰酸钾溶液热到细菌虫红显现为红色。
6. 清洗与固定：倾倒掉多余的染色剂和高锰酸钾溶液，用自来水彻底冲洗，将标本涂片风干或用吹风机吹干。
7. 反染：将涂片溶于酸酒红溶液中，温和地与酸酒红反应。
反应结束后，再次用自来水冲洗，风干，镜片上缀油。
临床应用：1. 结核菌检测：抗酸染色是诊断结核病的重要手段之一。
通过检测患者痰液、刮片等标本中的抗酸染色-阳性颗粒，可以快速、敏感、直观地进行结核分枝杆菌的检测和诊断。
2. 结核病确诊：抗酸染色技术作为结核病的初筛方法，可帮助医生进行早期诊断和治疗。
对于疑似结核病患者，通过抗酸染色检测可快速识别结核菌，指导早期治疗方案的制定。
3. 结核病治疗监测：抗酸染色技术可用于结核病治疗效果的评价和疗程的调整。
治疗过程中，定期检测患者的痰液标本，观察结核菌的存在和培养基的数量，以判断治疗效果并及时调整治疗策略。
微生物检验实验室抗酸染色标准操作规程
微生物检验实验室抗酸染色标准操作规程1．目的规范抗酸染色标准操作规程。
2．原理抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物状，此类细菌在石碳酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持紫色红色；而其他脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。
3．试剂3.1 Kinyoun溶液。
碱性品红40g 乙醇（95%）200ml 石碳酸80ml 蒸馏水1000ml3.2 Gabett溶液亚甲蓝10g 无水酒精300ml硫酸200ml 蒸馏水500ml4．质控每天用龟分支杆菌ATCC93326做阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照。
5.操作步骤5.1 初染涂片上滴加石碳酸复红液，用火焰加热至产生蒸汽，约5分钟，水洗。
5.2 脱色第二液脱色约1分钟，轻轻摇动玻片，无红色脱色或略呈粉红色时为止，水洗。
5.4 复染第三液复染30秒，水洗。
自然干燥后镜检。
6.结果判断抗酸杆菌呈红色。
7.注意事项7.1 每张玻片只能涂一份标本，禁止将2份或2份以上的标本涂在同一张载玻片上。
7.2 为防止交叉感染，标本应先高压灭菌后再涂片染色。
7.3 在涂抹痰标本时，严禁对载玻片进行加热。
7.4 菌龄为18～24小时为佳。
8.临床意义只针对用于结核病、麻风病等的细菌检查，初步诊断。
9.安全防护措施9.1操作人员要戴口罩、手套和穿隔离衣。
9.2涂片制备痰标本要高压灭菌或者在标本中加入等量0.5%“84”消毒液（含有效氯2500mg/L）后涂片。
气管刷片送检的玻片，紫外线灯下照射30分钟进行染色镜检。
或者对于进行抗酸染色的痰标本（因使用的容器原因不能高压灭菌）。
9.3镜检后的玻片均浸泡在含有效氯1000mg/L的消毒液中，高压灭菌后处理。
9.4所有标本、污染物丢弃之前，都需经高压灭菌、焚烧或浸泡杀菌剂中。
抗酸染色操作
抗酸染色操作程序【检验原理】抗酸染色可将细菌分为两大类，即抗酸性细菌和非抗酸性细菌，因日常大多数病原菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检测项目，只针对结核病等具有抗酸性细菌标本的染色。
【主要组成成分】1.石碳酸复红溶液2.脱色剂（3%盐酸酒精溶液）3.复染液（吕氏美兰溶液）【样本要求】1.直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率；2.直接用细菌染色，要注意防护，以防生物感染。
【检验方法】1.涂片经火焰固定，加1液徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。
染5分钟（若染色奴卡氏菌需要更长时间），水洗。
2.加第2液不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗；3.加3液，染0.5-1分钟，水洗。
4.干后油镜镜检。
【结果判断】分支杆菌在暗背景中呈红色，背景为蓝色。
镜检结果分级报告抗酸杆菌阴性（-）：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌抗酸杆菌阳性（报告抗酸杆菌菌数）：1~8条/300视野抗酸杆菌阳性（1+）：3~9条/100视野，连续观察300个视野抗酸杆菌阳性（2+）：1~9条/10视野，连续观察100个视野抗酸杆菌阳性（3+）：1~9条/每视野抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/每视野【注意事项】1、严格掌握脱色时间，要脱色充分，脱色时间过短易使红色的石炭酸复红染料残留显红色而造成假阳性。
2、在染片过程中，加1液后一定要酒精灯徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾，这样才能使细菌充分着色。
3、石碳酸对皮肤、粘膜有强烈的刺激性和腐蚀性，使用时要注意安全，如果不慎沾到皮肤上，立即用水或酒精冲洗。
4、涂片染色阳性只能说明抗酸杆菌的存在，不能区分是结核菌还是非结核分支杆菌。
细菌染色标本检查方法之抗酸染色法—萋-尼抗酸染色法
细菌染色标本检查方法之抗酸染色法—萋-尼抗酸染色法（1）实验材料①染色液。
石炭酸复红液、碱性美蓝溶液、3%盐酸酒精。
②菌种。
含结核分枝杆菌的痰标本。
③其他。
普通玻片、酒精灯、接种环及显微镜等。
（2）实验方法①涂片a、直接涂片和厚膜涂片。
用接种环挑取约0.01ml脓性或呈干酪样部分痰液，制成10mm*10mm 大小的均匀薄涂片，或取上述标本约0.1ml，制成20mm*15mm大小的厚膜涂片。
自然干燥，火焰固定后，行抗酸染色或金胺“0”荧光染色，镜检。
b、集菌涂片。
І、沉淀集菌法。
取痰液2—3ml，40g/lNaOH1—2倍量混匀。
经103.43Pa高压灭菌20—25min（或煮30min），3000r/min离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片做抗酸染色或金胺“0”荧光染色镜检；П、漂浮集菌法。
取晨痰2—3ml放入100ml三角瓶内，加1—2倍量40g/lNaOH溶液，经103.43Pa高压灭菌20—25min（或煮30min）。
冷却后滴加汽油0.3ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶口，置振荡器或手摇振荡10min，再加蒸馏水至满瓶口而又不外溢，静置10—15min，将已编号的洁净载玻片盖在瓶口上，静置15—20min，取下载玻片并迅速将载玻片翻转至浸膜向上，或用接种环取瓶口液面物涂于载玻片上，自然干燥，火焰固定后做抗酸染色或金胺“0”荧光染色，镜检。
②染色a、初染，在已固定的结核分枝杆菌痰标本涂片上放一小块滤纸片，之后滴加数滴石炭酸复红液后，将标本片放在火焰高处徐徐加温，当涂片上液体出现蒸汽时离开火焰（切不可煮沸），待玻片稍冷却后补充染液（以防干燥或玻片断裂），如此维持染色3—5min，待玻片冷却后用水冲洗，甩干。
b、脱色，在涂片上滴加数滴3%盐酸酒精，轻轻晃动玻片，直至无红色液体流下为止，一般作用1—3min，水洗，甩干。
c、复染，滴加数滴碱性美蓝液于涂片上，作用1min后，水洗，甩干。
用吸水纸印干标本片或自然干燥后油镜检查。
抗酸染色+标片
干燥
固定
2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30’’~1’；用水冲洗。
3）复染：用碱性美兰溶液复染1’，用水冲洗后用吸 水纸吸干。
3、油镜观察
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片 干燥 固定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染 脱色 复染
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’
冲洗
美蓝复染1 ’
用玻片夹夹持涂片标本滴加石炭酸复红23滴在火焰高处徐徐加热切勿沸腾出现蒸汽即暂时离开若染液蒸发减少应再加染液以免干涸加热35分钟待标本冷却后用水冲洗
医学微生物学实验
微生物学教研室
2011年12月
实验内容
一、细菌染色标本检查法 抗酸染色法（操作） 二、标本片观察： （钩体 、白色念珠菌，曲霉、枯草芽胞杆菌、）
3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥
油镜观察
三、抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序，
偶呈分枝状生长。
背景及非抗酸性细菌呈兰色。
注意事项：
1、无菌操作 2、菌种管摇匀后取菌 3、涂片均匀 4、初染加热维持3~5分钟，勿沸腾烧干 5、冷却后冲洗 6、油镜下从视野中找色
材料：
标本：卡介苗
染液：石炭酸复红，3%盐酸酒精，美蓝
器具：同革兰氏染色
实验方法：
1、细菌涂片标本的制备 涂片 2、染色
1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红 2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽 即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免 干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。
目的要求
掌握抗酸染色技术 掌握钩体，白色念珠菌、曲霉、枯草杆
抗酸染色标本片
10
注意事项：
1、无菌操作 2、菌种管摇匀后取菌 3、涂片均匀 4、初染加热维持3~5分钟，勿沸腾烧干 5、冷却后冲洗 6、油镜下从视野中找红色抗酸菌
11
二、标本片观察
白色念珠菌 钩体 枯草杆菌 曲霉
12
白色念珠菌
13
钩端螺旋体
14
类炭疽（枯草杆菌）
15
炭疽杆菌
曲霉
16
实验报告
6 3、油镜观察
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
7
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染
脱色
复染
冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’
3观察
美蓝复染1 ’
8
三、抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
2
目的要求
掌握抗酸染色技术 掌握钩体，白色念珠菌、曲霉、枯草杆
菌基本形态
3
一、抗酸染色原理
分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸， 它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要 经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的 分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名 抗酸染色。
白色念珠菌曲霉枯草芽胞杆菌目的要求掌握钩体白色念珠菌曲霉枯草杆菌基本形态分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质主要是分枝菌酸它包围在肽聚糖的外面所以分枝杆菌一般不易着色要经过加热和延长染色时间来促使其着色
医学微生物学实验
2011年12月
1
实验内容
一、细菌染色标本检查法 抗酸染色法（操作）
抗酸染色概要(1)
夹层杯抗酸染色制片法概要一：标本的预处理：消化和离心1.将标本至于夹层杯中加消化液消化至液体清亮（2~5分钟可灭活细菌）（若是其它容器取痰的，可小心的在痰上加些许消化液，待痰不再粘附其上后转入夹层杯）（夹层杯可装液体不超过杯身三分之二）（非痰类标本亦须加适量消化液消化）。
2.将本杯置于离心机内对称平衡放稳，以4500转/分钟转速离心5分钟，弃去液体（轻快的倒掉），放在干片机内烘烤（干片机提前开启至60度）。
二：染色：初染和洗脱和复染1.加A液在60度温度下染色5分钟。
2.B液脱色（尽量将红色脱净）。
3.C液复染一分钟。
（每次弃去染色液后需以缓慢小水流沿杯壁将杯中剩余液体洗清沥干）。
（加染液液量以可覆盖膜片为适量）三：制片：取片和阅片1.将染色后的片子烘干。
2.用取片针顶起杯底纳米膜片，用镊子夹出，轻轻印干水分，用中性胶倒封于玻片上，弃去保护膜。
（水分将会影响胶水对膜片的粘附）3.阅片。
（可利用“红十字”找寻视野）四：注意事项1.膜片上的细菌的保护：本制片法的原理为通过离心沉降并烘烤将目标菌粘附在膜片上后进行染色，在操作过程中必须避免直接冲刷、液体剧烈振荡、大力印擦等而将膜上已粘附的细菌冲走，这些失误会严重影响阳性率。
2.各标本间的交叉污染：标记混淆、杯中液体互溅、液体转移等将会使结果严重不可靠。
3.脱色的程度：脱色不完全将导致膜上非抗酸菌或其它物质也呈现红色，脱色过久过重会影响抗酸杆菌所着色，二者都将影响后续镜检。
4.B液：其重要成分为酒精盐酸，易挥发，用完务必盖好盖子。
5.操作时间段的把握：请有效利用机器与时间间隔，避免标本堆积。
抗酸染色鸡胚接种
2. 消毒
• 气室向上放置鸡胚于卵架上； • 先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋壳所标记的位置。
距气室底边0.5cm
3. 打孔
• 在所标记注射部位用剪刀尖端打孔； • 注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。
3、油镜观察
三、抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
注意事项：
1、无菌操作 2、菌种管摇匀后取菌 3、涂片均匀 4、初染加热维持3~5分钟，勿沸腾烧干 5、冷却后冲洗 6、油镜下从视野中找红色抗酸菌
鸡胚培养与病毒滴度检测
一、目的要求
2. 新城疫病毒
① 副粘病毒科/副粘病毒亚科/禽腮腺炎病毒属。 ② 新城疫的病原体。 ③ 形态：
• 病毒子多呈球形； • 单股负股RNA； • 核衣壳螺旋形对称； • 有囊膜； • 囊膜表面有纤突。
④ 血凝性：可凝集人、鸡、豚鼠和小白鼠的红细胞。 ⑤ 病毒分离培养：9~11日龄鸡胚尿囊腔接种。
三、实验材料
⑤ 取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病 理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。
8. 新城疫病毒滴度的检测 血凝试验（HA）
编码
NS
病毒液
RBC
效价
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.4 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
0.1
倍比稀释
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种： • 羊膜腔接种 • 静脉接种
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抗酸染色
一、原理
本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。
齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。
二、试剂
石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液
三、方法
1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰
2.固定：常用高温进行固定。
即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。
要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色
3.染色
3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温
3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水
3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止
3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水
3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟
3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检
3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块
四、结果判定
1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色
2. 报告方式
2.1 未找到抗酸杆菌
2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野
2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野
2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野
2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野
2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野
五、注意事项
1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆
2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止
3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长
4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意
5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射
6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热
7. 染色时勿使玻片上的染液干燥
六、临床意义
分支杆菌属（结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、非典型分支杆菌）、放线菌抗酸染色阳性，可初步鉴定细菌。