一株鸭副粘病毒的分离与鉴定
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图 １ Ｒ 、 Ｃ 产 物 的 电泳 结 果 ｑ 一Ｐ Ｒ １ 分 子 置 标 准 ； ． Ｃ 产 物 ． ２Ｐ Ｒ
２ ２ 重 组 质 粒 的 鉴 定 ．
通 过 蓝 白斑 筛 选 ， 用 Ｐ Ｒ 反 应 ， 阳 性 重 组 和 对 照 菌 利 Ｃ 对 做进 一 步 的 鉴 定 。 Ｐ Ｒ 扩 增 反 应 体 系 （ ５ Ｉ： ０× Ｔ ｑ Ｃ ２ ） １ ａ Ｂ ｆ ｒ ． ｌＴ ｑＤ ｕｆ ５ ｔ ， ａ ＮＡ 聚 合 酶 ０ ５ ｌｄ Ｔ ２ ５ ｍ ｌＬ ｅ２ ＊ ． ， Ｎ Ｐ（ ． ｍｏ／ ） ｌ ， １０５ ｌＰ ． ｌ菌 液 ４ｐ，ｄ ２ ２ ； 环 参 数 Ｐ ． 、 ２０ ５ ， ． ｄ Ｈ Ｏ １ ｌ循 １ 为 ：５ ５ｍｉ，４ ３ ，５ ３ ，２ ６ ，３个 循 环 ； ９ ℃ ｎ ９ ℃ ０Ｓ ５ ℃ ０Ｓ ７ ℃ ０Ｓ３ ７ ℃ １ ｎ 反应 结束 后 取 ５ ｌ Ｃ 扩 增 产物 ， ２ Ｏ ２ ０ｍｉ。 Ｒ Ｐ 用 ． ％琼 脂 糖凝 胶 进 行 电泳 分 析 ， 图 ２ 示 。 如 所
后 收 取尿 囊 液 ， 传 ３代 。 盲
１ ２ 主 要 试 剂 ．
Ｔ ｉ ｅ ｇｎ 为 Ｔ ｋ ｌ 公 司 产 品 ； 体 系 统 ｐ Ｍ —Ｔ ｒ Ｒ ａｅｔ ￣ｌ ａａ ａ 载 ＧＥ ｅｓ ａｙ载 体 、 ａ Ｎ 聚 合 酶 和 Ｔ Ｎ 连 接 酶 购 自 Ｔ ｑＤ Ａ ４Ｄ Ａ Ｐｏ ｇ 公 司 ； ｒｍｅａ 氨苄 青 霉 素 、 Ｘ—ｇｌＩＴ 等 均 购 自上 海 英 竣 ａ、Ｐ Ｇ 生 物技 术 有 限 公 司 ； Ｎ 回 收 纯 化 试 剂 盒 和 质 粒 提 取 纯 化 Ｄ Ａ 试 剂 盒购 自 Ｏ ｇ 公 司 。 ｍｅ ａ
膜炎 症 状 ， 胃与 肌 胃交 界 处 偶 有 出 血 带 ， 吸 道 气 管 内粘 腺 呼
２ 结 果 与 分 析
２ １ 分 离毒株 的 Ｒ ． Ｔ—Ｐ Ｒ扩增 结果 Ｃ
应用 Ｒ Ｔ～Ｐ Ｒ 进行 扩 增 ， 到 与 预 计 大 小 相 符 的 目的 Ｃ 得 片段 ， 图 ｌ所 示 。 如
液增 多 或 者轻 微 出血 ， 步 诊 断 为 鸭 副粘 病 毒 病 。 初
１ 材 料 与 方 法
１１ 病毒 分 离 ．
取 发病 鸭 的 肝 、 等 组 织 剪 碎 ， １ ３加 入 灭 菌生 理 盐 脾 按 ： 水 匀 浆 ， ０ ／ ｎ离 心 １ ｉ ， 上 清 用 ０ ２ ｍ 的 过 滤 ３０ ０ ｒｍｉ ５ｍｎ 取 ２ 器过滤， 接种 ９日龄 Ｓ Ｆ鸡 胚 ，７ 孵 育 。弃 去 ２ 死 亡 鸡 Ｐ ３℃ ４ｈ 胚 ， 天 照蛋 ２次 ， 集死 亡 鸡 胚 ， 置 于 ４ 冰 箱 保 存 １ 每 收 放 ℃ ２ｈ
２０ ０ ９年 ３ ， 东 省 某 番 鸭 场 暴 发 疑 似 副 粘 病 毒 （ Ｐ 月 广 Ａ — Ｍｖ） 。 临床 症 状 主要 表 现 为 ： 病 咳嗽 、 吸 困 难 ， 引 发 产 蛋 呼 并 明 显 下降 症 状 。解 剖 显 著 病 变 主 要 在 肠 道 ， 十 二 指 肠 、 在 卵 黄 蒂 附近 有枣 核 状 溃 疡 和 出血 ， 盲肠 之 间 的 回肠 淋 巴结 有 枣 核状 隆 起 出血 ， 肠 粘 膜 有 弥 漫 性 出 血 ， 典 型 的 卵 黄 性 腹 小 有
ｍｍｏ ／ ｇ ２ ２ ｖ 、 ０ ｍｍｏ／ ＮＴＰ １ ｌ Ｐ１ ． ｌ Ｐ ｌ Ｌ Ｍ ＣＩ ｌ １ ［Ｌ ｄ 、 ０ ５ 、２
图 ２ 蘑 组 阳 性 质 粒 的 鉴 定
１ ３ 总 ０ Ｔ ｉ 试 剂 ， 匀 后 按 ０ 尿 ０ ｒ ￣ｌ 混
Ｔ ｉ ｌ 明书 要求 提 取 病 毒 Ｒ Ａ。 ｒｏ说 ｚ Ｎ
１ ４ 引 物设 计 与 合 成 ．
根 据 Ｇ ｎ ａｋ已发 表 的 Ｆ基 因 序 列 设 计 Ｐ Ｒ 引 物 ， ｅＢ ｎ Ｃ 引 物 序 列 如 下 ： 上 游 引 物 Ｐ 序 列 ： ５’ Ｇ Ａ ｌ Ｃ Ａ— Ｇ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ｃ３ ， 游 引 物 Ｐ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ ’ 下 ２序 列 ： ’ Ｇ Ａ ５ Ｃ Ｇ Ｇ— Ｇ Ｔ Ｔ ＧＧ Ａ Ｃ ＇ ３ ， Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｉ ’ 扩增 长度 约 为 ４ ３ｂ ， 含 Ｆ基 因 、 ６ ｐ 包 裂 解 位点 ， 引物 由上 海英 竣 生 物 技 术 有 限 公 司合 成 。
１． ＲＴ — ＰＣＲ ５
●■曩
ｃＮ Ｄ Ａ第 一 条链 合 成 ： ２ ｔ 反 应 体 积 中 ， 有 １ 在 Ｏ ｌ 含 ０ Ｒ Ａ， Ｂ ｆ ｒ ｌ１ ｏ／ ＮＴ Ｎ ５× ｕｆ ，０ｍｍ ｌＬ ｄ Ｐ混合 液 ２ ， 转 录 酶 ｅ４ ｌ逆 １ｔ ， Ｎ ｓ 抑 制剂 １ ｌ随机 引物 ２ ｌ于 ４ ℃ 水 浴 反 应 １ ， ｌ ａｅ ＊Ｒ ， ， ２ ｈ ９ ℃ ５ｍｉ后 冰 浴 ２ｍｉ， 一２ ℃ 备 用 。 ５ ｎ ｎ置 ０ Ｐ Ｒ扩 增 ｃ Ｎ 片 段 ： ｅ Ｄ Ａ 以反 转 录 产 物 为 模 板 进 行 Ｐ Ｒ Ｃ 扩增， 反应 在 ２ 体 系 中 进 行 ： ０×Ｐ Ｒ ｂ ｆ ｒ ． ｌ２ ５ １ Ｃ ｕｆ ５ 、 ５ ｅ２
・
５ ・ ６
《 海畜牧兽 医通讯》 ２ １ 上 ０ ０年 第 １ 期
一
株 鸭 副粘病 毒 的分 离与鉴 定
周 全 温 纳 相 高 恒 宋 永 峰 周 丽 钟 锦 伦 ５ ７０ ２ ４ ０）
（广 东 温 氏 集 团研 究 院禽 病 研 究 中 心 广 东 新 兴
图 １ Ｒ 、 Ｃ 产 物 的 电泳 结 果 ｑ 一Ｐ Ｒ １ 分 子 置 标 准 ； ． Ｃ 产 物 ． ２Ｐ Ｒ
２ ２ 重 组 质 粒 的 鉴 定 ．
通 过 蓝 白斑 筛 选 ， 用 Ｐ Ｒ 反 应 ， 阳 性 重 组 和 对 照 菌 利 Ｃ 对 做进 一 步 的 鉴 定 。 Ｐ Ｒ 扩 增 反 应 体 系 （ ５ Ｉ： ０× Ｔ ｑ Ｃ ２ ） １ ａ Ｂ ｆ ｒ ． ｌＴ ｑＤ ｕｆ ５ ｔ ， ａ ＮＡ 聚 合 酶 ０ ５ ｌｄ Ｔ ２ ５ ｍ ｌＬ ｅ２ ＊ ． ， Ｎ Ｐ（ ． ｍｏ／ ） ｌ ， １０５ ｌＰ ． ｌ菌 液 ４ｐ，ｄ ２ ２ ； 环 参 数 Ｐ ． 、 ２０ ５ ， ． ｄ Ｈ Ｏ １ ｌ循 １ 为 ：５ ５ｍｉ，４ ３ ，５ ３ ，２ ６ ，３个 循 环 ； ９ ℃ ｎ ９ ℃ ０Ｓ ５ ℃ ０Ｓ ７ ℃ ０Ｓ３ ７ ℃ １ ｎ 反应 结束 后 取 ５ ｌ Ｃ 扩 增 产物 ， ２ Ｏ ２ ０ｍｉ。 Ｒ Ｐ 用 ． ％琼 脂 糖凝 胶 进 行 电泳 分 析 ， 图 ２ 示 。 如 所
后 收 取尿 囊 液 ， 传 ３代 。 盲
１ ２ 主 要 试 剂 ．
Ｔ ｉ ｅ ｇｎ 为 Ｔ ｋ ｌ 公 司 产 品 ； 体 系 统 ｐ Ｍ —Ｔ ｒ Ｒ ａｅｔ ￣ｌ ａａ ａ 载 ＧＥ ｅｓ ａｙ载 体 、 ａ Ｎ 聚 合 酶 和 Ｔ Ｎ 连 接 酶 购 自 Ｔ ｑＤ Ａ ４Ｄ Ａ Ｐｏ ｇ 公 司 ； ｒｍｅａ 氨苄 青 霉 素 、 Ｘ—ｇｌＩＴ 等 均 购 自上 海 英 竣 ａ、Ｐ Ｇ 生 物技 术 有 限 公 司 ； Ｎ 回 收 纯 化 试 剂 盒 和 质 粒 提 取 纯 化 Ｄ Ａ 试 剂 盒购 自 Ｏ ｇ 公 司 。 ｍｅ ａ
膜炎 症 状 ， 胃与 肌 胃交 界 处 偶 有 出 血 带 ， 吸 道 气 管 内粘 腺 呼
２ 结 果 与 分 析
２ １ 分 离毒株 的 Ｒ ． Ｔ—Ｐ Ｒ扩增 结果 Ｃ
应用 Ｒ Ｔ～Ｐ Ｒ 进行 扩 增 ， 到 与 预 计 大 小 相 符 的 目的 Ｃ 得 片段 ， 图 ｌ所 示 。 如
液增 多 或 者轻 微 出血 ， 步 诊 断 为 鸭 副粘 病 毒 病 。 初
１ 材 料 与 方 法
１１ 病毒 分 离 ．
取 发病 鸭 的 肝 、 等 组 织 剪 碎 ， １ ３加 入 灭 菌生 理 盐 脾 按 ： 水 匀 浆 ， ０ ／ ｎ离 心 １ ｉ ， 上 清 用 ０ ２ ｍ 的 过 滤 ３０ ０ ｒｍｉ ５ｍｎ 取 ２ 器过滤， 接种 ９日龄 Ｓ Ｆ鸡 胚 ，７ 孵 育 。弃 去 ２ 死 亡 鸡 Ｐ ３℃ ４ｈ 胚 ， 天 照蛋 ２次 ， 集死 亡 鸡 胚 ， 置 于 ４ 冰 箱 保 存 １ 每 收 放 ℃ ２ｈ
２０ ０ ９年 ３ ， 东 省 某 番 鸭 场 暴 发 疑 似 副 粘 病 毒 （ Ｐ 月 广 Ａ — Ｍｖ） 。 临床 症 状 主要 表 现 为 ： 病 咳嗽 、 吸 困 难 ， 引 发 产 蛋 呼 并 明 显 下降 症 状 。解 剖 显 著 病 变 主 要 在 肠 道 ， 十 二 指 肠 、 在 卵 黄 蒂 附近 有枣 核 状 溃 疡 和 出血 ， 盲肠 之 间 的 回肠 淋 巴结 有 枣 核状 隆 起 出血 ， 肠 粘 膜 有 弥 漫 性 出 血 ， 典 型 的 卵 黄 性 腹 小 有
ｍｍｏ ／ ｇ ２ ２ ｖ 、 ０ ｍｍｏ／ ＮＴＰ １ ｌ Ｐ１ ． ｌ Ｐ ｌ Ｌ Ｍ ＣＩ ｌ １ ［Ｌ ｄ 、 ０ ５ 、２
图 ２ 蘑 组 阳 性 质 粒 的 鉴 定
１ ３ 总 ０ Ｔ ｉ 试 剂 ， 匀 后 按 ０ 尿 ０ ｒ ￣ｌ 混
Ｔ ｉ ｌ 明书 要求 提 取 病 毒 Ｒ Ａ。 ｒｏ说 ｚ Ｎ
１ ４ 引 物设 计 与 合 成 ．
根 据 Ｇ ｎ ａｋ已发 表 的 Ｆ基 因 序 列 设 计 Ｐ Ｒ 引 物 ， ｅＢ ｎ Ｃ 引 物 序 列 如 下 ： 上 游 引 物 Ｐ 序 列 ： ５’ Ｇ Ａ ｌ Ｃ Ａ— Ｇ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ｃ３ ， 游 引 物 Ｐ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ ’ 下 ２序 列 ： ’ Ｇ Ａ ５ Ｃ Ｇ Ｇ— Ｇ Ｔ Ｔ ＧＧ Ａ Ｃ ＇ ３ ， Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｉ ’ 扩增 长度 约 为 ４ ３ｂ ， 含 Ｆ基 因 、 ６ ｐ 包 裂 解 位点 ， 引物 由上 海英 竣 生 物 技 术 有 限 公 司合 成 。
１． ＲＴ — ＰＣＲ ５
●■曩
ｃＮ Ｄ Ａ第 一 条链 合 成 ： ２ ｔ 反 应 体 积 中 ， 有 １ 在 Ｏ ｌ 含 ０ Ｒ Ａ， Ｂ ｆ ｒ ｌ１ ｏ／ ＮＴ Ｎ ５× ｕｆ ，０ｍｍ ｌＬ ｄ Ｐ混合 液 ２ ， 转 录 酶 ｅ４ ｌ逆 １ｔ ， Ｎ ｓ 抑 制剂 １ ｌ随机 引物 ２ ｌ于 ４ ℃ 水 浴 反 应 １ ， ｌ ａｅ ＊Ｒ ， ， ２ ｈ ９ ℃ ５ｍｉ后 冰 浴 ２ｍｉ， 一２ ℃ 备 用 。 ５ ｎ ｎ置 ０ Ｐ Ｒ扩 增 ｃ Ｎ 片 段 ： ｅ Ｄ Ａ 以反 转 录 产 物 为 模 板 进 行 Ｐ Ｒ Ｃ 扩增， 反应 在 ２ 体 系 中 进 行 ： ０×Ｐ Ｒ ｂ ｆ ｒ ． ｌ２ ５ １ Ｃ ｕｆ ５ 、 ５ ｅ２
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５ ・ ６
《 海畜牧兽 医通讯》 ２ １ 上 ０ ０年 第 １ 期
一
株 鸭 副粘病 毒 的分 离与鉴 定
周 全 温 纳 相 高 恒 宋 永 峰 周 丽 钟 锦 伦 ５ ７０ ２ ４ ０）
（广 东 温 氏 集 团研 究 院禽 病 研 究 中 心 广 东 新 兴