骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展.

骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展

邴爱英宋文刚

(泰山医学院 , 山东泰安 271016

关键词 :骨髓间充质干细胞 ; 分离培养 ; 生物学特性

中图分类号 :R392文献标识码 :A 文章编号 :1004-7115(2011 07-0549-04

骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells , BMSCs 亦称骨髓基质干细胞 (bone mar-row stromal cells , BMSCs , 是主要存在于机体骨髓腔中的一种干细胞 , 在一定的诱导条件下 , 可分化为多种胚层细胞 [1－2], 更重要的是骨髓间充质干细胞具有较强的免疫调节功能 , 进行异体移植时可避免免疫排斥反应 [3], 故对骨髓间充质干细胞的研究越来越受到广泛的关注。

20世纪 70年代中期 , Friedenstein 等首次报道 , 骨髓标本中小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化形成类似骨、软骨的集落 , 并将之称为骨髓多能间充质干细胞 (marrow pluripotent stromal cells , 又称 BMSCs 。 1997年 , Prockop 成功分离出BMSCs , 发现其具有多向分化潜能 , 可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞和成肌细胞等。近年来 , 人们在研究中建立了人、猴、兔、大鼠等不同种属 BMSCs 的培养体系 , 其取材部位及方式等各有不同。

1骨髓间充质干细胞的分离与培养

BMSCS 的含量很低 , 约占骨髓有核细胞的 0. 001% 0. 010%左右 , 并且随着年龄增长递减 , 要利用 BMSCS 就必须实现 BMSCS 的体外分离培养和扩增。目前对骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养还没有统一的方法 , 现在较为常用的分离方法主要有 :贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法。前两种方法获得的骨髓间充质干细胞成分复杂 , 纯度不够高。而用流式细胞仪和免疫磁珠分离技术虽然可获得高纯度的骨髓间充质干细胞 , 但对细胞活性和分化能力有较大影响 , 而且实验条件要求高 , 需要骨髓量较大。目前最

常用的是贴壁筛选法与密度梯度离心法相结合的方法 , 既可以增加分离 BMSCs 的纯度 , 又避免影响 BMSCs 的活性 , 而且操作简便 , 成本不高 [4]。

1．1贴壁筛选法贴壁筛选法是骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法 , 是由Friedenstein 在 19世纪 70年代中期建立的。它是根据 BMSCs 在塑料培养瓶中贴壁生长的特性 , 通过定期换液除去不贴壁细胞 , 从而达到分离、纯化 BMSCs 的目的。 Frieden-stein 等的工作创建了一种体外分离和培养的简便可行的方法。至今该方法仍是一种得到广泛应用的经典途径。

1．2密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同 , 使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞 , 再进行贴壁培养 , 从而达到分离、纯化 BMSCs 的目的。 Pittenger 等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到 95%。

1．3流式细胞仪和免疫磁珠法常用方法为免疫磁珠法 , 是利用免疫学的技术分离 BMSCS , 分离细 945

泰山医学院学报

JOURNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011

*基金项目 :国家自然科学基金项目 (30872322 。山东省自然科学基金项目 (2009ZRB01841 。泰山医学院科研计划课题 (20092RQN019 。

作者简介 :邴爱英 (1977— , 女 , 山东即墨人 , 讲师 , 硕士 , 主要从事医学免疫学实验教学和研究工作。

胞的纯度高。 Phinney [5]用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来 , 提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法 , 但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记 ; 而且 , 这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响 , 造成 BMSCS 损伤 , 出现增殖缓慢等问题 , 这些技术问题很

大程度上限制了这两种方法的应用。因此 , 如何能简便高效地获得均质性的间充

质干细胞和细胞群仍需要继续探索。

1．4BMSCs 的培养、扩增最常用的是 LG-DMEM 培养基 , 含体积分数 10% 20%的胎牛血清 , 其中体积分数 10%的胎牛血清最有利于 BMSCs 的贴壁、扩增

及多系潜能的维持 , 体积分数过高时 , 血清中含有大量促进细胞增殖分化的因子 , 容易使细胞过早出现老化。但如果 BMSCS 要应用于临床治疗 , 则 BMSCS 应尽

量避免和胎牛血清或新生牛血清的接触 , 以避免污染疯牛病毒和异体蛋白增加的过敏风险。目前已有多项研究使用脐带血血清或人自体血清替代胎牛血清用于BMSCs 的培养 , 这样既可以避免上述风险 , 又因此类血清中含多种细胞因子 , 可

促进 BMSCs 的增殖、分化 , 因此为临床提供了一种安全有效的培养方法。此外 , 种植密度、氧体积分数及细胞因子都对 BMSCs 的培养有一定影响 , Lennon 等认为低密度种植有益于细胞扩增 , 氧体积分数低于 20%有利于干细胞功能的存留 , 血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子亦有较强的促进增殖作用。

2骨髓间充质干细胞的生物学特性

骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织 , 由基质细胞和细胞间基质构成。 BMSCS 主要有如下特性 :①形态学特征 ; ②具有自我复制、增殖能力 ; ③间充质干细胞的表面抗原标记 ; ④具有多向分化的能力。

2．1骨髓间充质干细胞的形态学特征

体外培养的 BMSCS 体积小 , 成梭形或多角形 , 核浆比大 , 多为平行排列生长

或漩涡状生长 , 部分贴壁细胞可以快速形成集落 , 一些呈典型的纺锤形样的BMSCS 增殖迅速 , 形态均一。细胞传代后 , 传代细胞较原代细胞的贴壁速度快 , 细胞传到第 3代时 , 细胞形态比较一致。

在光镜和相差显微镜下 , BMSCS 为长梭形 , 类似成纤维细胞外观。透射电镜下 BMSCS 可表现为两种不同的形态结构类型 :一种是处于相对静息状态的细胞 ,