鲍曼不动杆菌噬菌体生物学特性的研究_余静丹
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［67 ］
异戊醇（ 25 24 1 ） （ 北京鼎国昌盛生物技术 DNase I 和 RNase A 有限责任公司 ） ； TM 缓冲液、 （ Sigma 公 司 ） ； 蛋 白 酶 K 和 考 马 斯 亮 蓝 R250 （ Amresco 公 司 ） ； Hind Ⅲ、 EcoR Ⅰ、 EcoR Ⅴ、 BamH Ⅰ、 Nde Ⅰ、 Afl Ⅰ、 Xba Ⅰ和 Pst Ⅰ（ TaKaRa 公司） 。 1 ． 2 方法 1． 2． 1 鲍曼不动杆菌的鉴定 16 株鲍曼不动杆 菌的初步鉴定包括： 革兰染色， 需氧情况， 氧化酶
doi： 10． 3969 / j． issn． 1005 － 7021． 2013． 02． 004
Biologic characteristics of Bacteriophages specific to Acinetobacter baumannii
YU Jingdan，SHI Hongyan，WANG Dan，XU Hua，SUN Yanbo
微生物学杂志
2013 年 4 月第 33 卷 第 2 期
JOURNAL OF MICROBIOLOGY Apr． 2013 Vol． 33 No． 2
17
鲍曼不动杆菌噬菌体生物学特性的研究
余静丹，史红艳，王 丹，徐 花，孙延波
*
（ 吉林大学白求恩医学院 病原生物学系， 吉林 长春 130021 ）
摘
18
微 Podoviridae． Keywords
生
物
学
杂
志
33 卷
Acinetobacter baumannii； bacteriophages； onestep growth curve
鲍曼不动杆菌属非发酵、 氧化酶阴性、 触酶阳 ， 、 性的革兰阴性杆菌 存在于自然界的水 土壤和医 是医院获得性感染的主要条件致病菌之 院环境， ［12 ］ ， 一 可引起住院病人的呼吸道﹑泌尿道和伤口 也是引起烧伤感染的病原菌。 近年来随 的感染， 着抗生素的大量使用， 鲍曼不动杆菌的耐药率不 断上升。2009 年中国 CHINET 鲍曼不动杆菌细菌 ［3 ］ 耐药性监测显示 ， 鲍曼不动杆菌对青霉素类和 对亚胺培 头孢类抗生素的耐药率均高于 53． 3% ， 南和美罗培南的耐药率分别为 54． 8% 和 57． 2% ， 这给治疗和控制感染带来很多困难。 此外， 由于 多重耐药和泛耐药鲍曼不动杆菌菌株的出现， 在 非发酵革兰阴性杆菌中鲍曼不动杆菌成为仅次于 铜绿假 单 胞 菌 引 起 的 医 院 内 感 染 的 重 要 致 病 ［45 ］ 。最近针对细菌感染的噬菌体疗法重新受 菌 到人们的关注。 噬菌体是细菌的病毒， 广泛分布 于自然环境中。鉴于噬菌体对细菌裂解的特异性 和高效性， 相关领域的科研人员和部分生物医药 开展了一系列 公司在噬菌体抗细菌性感染方面， 。由 的基础性研究和噬菌体生物制剂的开发 于噬菌体在细菌性感染 （ 特别是多重耐药性细菌 和超级细菌所致的感染 ） 中可发挥重要作用， 因 ， 此 开展噬菌体及其噬菌体疗法的研究有着重要 的现实意义和潜在的应用价值。
1
1． 1
材料与方法
材料
1． 1． 1
菌株 16 株鲍曼不动杆菌由吉林大学中 日联谊医院检验科提供， 菌株经法国生物梅里埃
32 全自动微生物分析鉴定系统鉴定。 公司 VITEK质控菌株： 大肠埃希菌 ATCC 25922 ， 铜绿假单胞 菌 ATCC 27853 ； 其他菌株： 大肠埃希菌 3 株， 铜绿 假单胞菌、 肺炎克雷伯菌、 普通变形杆菌、 阴沟肠 杆菌、 伤寒沙门菌和福氏痢疾杆菌各 1 株， 由本教 研室鉴定并保存。 1． 1． 2 胰蛋白胨、 酵母浸粉 （ 北京奥博星生物技术有限责任公司 ） ； 营养琼脂 主要试剂与工具酶
ological characteristics to provide early stage's work for the development of biopreparation of phage aiming at bacterial infection． Splittable BAB was isolated and identified using doublelayeragar method． Its size and morphology was observed and examined by electron microscopy using negativestaining． The optimal multiplicity of infection and onestep growth curve of the phages were measured by mixing host bacteria and the phages in different proportions． The extracted genomes of the phages were evaluated on electrophoresis and digested with restriction enzymes． SDSPAGE was employed for analysis of the structural and nonstructural proteins of the phages． And it was successfully isolated three splittable BAB respectively named as ФAb1 ，ФAb2 and ФAb3 ，transmission electron microscopy showed that head of the phages assumed an icosahedra， 50 nm in diameter，having a short tail． The multiplicity of infection of phage 1 was 10 － 2 ，and onestep growth curve revealed that the latent phase was 20 min，and the eruptive 30 min，and ФAb1 was 190 PFU / infected cells． Restriction enzyme electrophoresis showed that the the splitting amount of phage ФAbsize of genome of phage ФAb1 was about 40 kb with a circular doublestranded DNA． SDSPAGE analysis indicated protein electrophoresis of the phage included 7 bands with molecular weight around 29 ～ 116 ku． Phage ФAb1 ，ФAb2 and ФAb3 had very strong splitting virulence against A． baumannii，and it was isolated and identified according its morphology，structure，and phage taxonomy． A． baumannii belonged to the order of Caudovirales，and the family of
要
从污水中分离鉴定鲍曼不动杆菌噬菌体， 并对其生物学特性进行分析， 为开发针对细菌感染的噬菌
体生物制剂提供前期工作 。采用双层琼脂法分离可裂解鲍曼不动杆菌的噬菌体， 通过负染法电镜观察噬菌体 将噬菌体和宿主菌以不同比例混合， 测定噬菌体的最佳感染复数并观察一步生长曲线， 提取噬 的大小和形态， PAGE 分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白 。 成功分离 3 株可裂解鲍 菌体核酸进行酶切电泳分析， 通过 SDS1、 2 和 ФAb3） ， ФAb电镜显示噬菌体的头部呈二十面体， 直径约 50 曼不动杆菌的噬菌体（ 分别命名为 ФAbnm， 1 的最佳感染复数为 10 － 2 ， 有一短尾。噬菌体 ФAb一步生长曲线表明噬菌体在裂解宿主菌时， 潜伏期为 20 min， 1 的基因组大小约 40 kb 爆发期为 30 min， 裂解量为 190 PFU / cell。限制性酶切电泳显示噬菌体 ФAbPAGE 的噬菌体蛋白电泳包括 7 种蛋白， 1、 左右， 为双股环状 DNA。SDS分子量在 29 ～ 116 ku。 噬菌体 ФAb2 和 ФAb3 对鲍曼不动杆菌具有很强的裂解毒性 。根据其形态、 ФAb结构和噬菌体分类法， 鲍曼不动杆菌噬 菌体属于有尾病毒目， 足尾病毒科。 关键词 鲍曼不动杆菌； 噬菌体； 一步生长曲线 Q939． 48 文献标识码 A 文章编号 1005 － 7021 （ 2013 ） 02 － 0017 － 07 中图分类号
（ Dept． of Pathogenobiol． ，Norman Bethune Coll． of Med． ，Jilin Uni． ，Changchun 1Βιβλιοθήκη Baidu0021 ）
Abstract
Bacteriophages specific to Acinetobacter baumannii （ BAB） isolated from sewage was investigated for its bi-
和触酶试验。 根据 GenBank 查询鲍 曼 不 动 杆 菌 16S rRNA 基因序列 （ Accession： Z93435 ） ， 并设计 通过多聚酶链反应， 进一步确认鲍曼不动杆 引物， ACTGGGCGTA菌。设计序列如下： 上游引物： 5'AAGCGTGCGTAGG3' ； 下 游 引 物： 5'TATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCT3' 。扩增目的基因的 PCR 反应条件： 95 ℃ 5 min， 94 ℃ 长度为 436 bp， 40 s， 58 ℃ 40 s， 72 ℃ 1 min， 35 个循环； 72 ℃ 10 min。 1． 2． 2 8］ ， 参照文献［ 取 吉林大学第三医院污水站未处理的污水 1 L， 加 噬菌体的分离与纯化 CaCl2 至终浓度 1 mmol / L， 加入 16 株新鲜培养的 鲍曼不动杆菌宿主菌悬液和 LB 培养基 50 mL， 置 37 ℃ 过夜培养。 次日离心除菌， 取上清用 0． 22 μm 过滤器滤过除菌。分别以 16 株鲍曼不动杆菌 为宿主菌， 与滤过液混合静止 15 min， 加入融化的 0． 7% LB 琼脂（ 50 ℃ ） 并均匀地铺在固体营养琼 37 ℃ 培养 16 ～ 18 h， 观察噬菌斑形成 脂平板上， 挑取单个噬菌斑接种至对 情况。噬菌斑形成时， 应的宿主菌进行扩增， 单个噬菌斑经 3 ～ 5 次反复 纯化后可得到较纯化的噬菌体。 细菌的裂解液经 10 000 × g 离心后， 取上清作连续 10 倍稀释， 取 100 μL 加入 0． 2 mL 相应的宿主菌， 制备噬菌斑 并测定噬菌体滴度 （ PFU / mL ） ， 噬菌体滴度 = 稀 释倍数 × 噬菌斑数 × 10 （ PFU / mL） 。 1． 2． 3 噬菌体的电镜观察 取噬菌体颗粒悬液 20 μL 滴于铜网上， 待其自然沉淀 15 min， 用滤纸 从侧面吸干多余的液体， 加 1 滴 2% 磷钨酸到铜网 上， 染色 10 min， 待铜网干燥后进行电镜观察。 1． 2． 4 噬菌体核酸提取和酶切图谱 在噬菌体
基金项目： 国家自然科学基金（ 81150037 ） 作者简介： 余静丹 女， 硕士研究生。研究方向为噬菌体的生物学和分子遗传学。 * 通讯作者。男， 85619574 ， Email： sunyb@ jlu． edu． cn 教授。研究方向为噬菌体疗法在耐药性细菌中的应用 。Tel： 04310828 ； 修回日期： 20121225 收稿日期： 2012-
异戊醇（ 25 24 1 ） （ 北京鼎国昌盛生物技术 DNase I 和 RNase A 有限责任公司 ） ； TM 缓冲液、 （ Sigma 公 司 ） ； 蛋 白 酶 K 和 考 马 斯 亮 蓝 R250 （ Amresco 公 司 ） ； Hind Ⅲ、 EcoR Ⅰ、 EcoR Ⅴ、 BamH Ⅰ、 Nde Ⅰ、 Afl Ⅰ、 Xba Ⅰ和 Pst Ⅰ（ TaKaRa 公司） 。 1 ． 2 方法 1． 2． 1 鲍曼不动杆菌的鉴定 16 株鲍曼不动杆 菌的初步鉴定包括： 革兰染色， 需氧情况， 氧化酶
doi： 10． 3969 / j． issn． 1005 － 7021． 2013． 02． 004
Biologic characteristics of Bacteriophages specific to Acinetobacter baumannii
YU Jingdan，SHI Hongyan，WANG Dan，XU Hua，SUN Yanbo
微生物学杂志
2013 年 4 月第 33 卷 第 2 期
JOURNAL OF MICROBIOLOGY Apr． 2013 Vol． 33 No． 2
17
鲍曼不动杆菌噬菌体生物学特性的研究
余静丹，史红艳，王 丹，徐 花，孙延波
*
（ 吉林大学白求恩医学院 病原生物学系， 吉林 长春 130021 ）
摘
18
微 Podoviridae． Keywords
生
物
学
杂
志
33 卷
Acinetobacter baumannii； bacteriophages； onestep growth curve
鲍曼不动杆菌属非发酵、 氧化酶阴性、 触酶阳 ， 、 性的革兰阴性杆菌 存在于自然界的水 土壤和医 是医院获得性感染的主要条件致病菌之 院环境， ［12 ］ ， 一 可引起住院病人的呼吸道﹑泌尿道和伤口 也是引起烧伤感染的病原菌。 近年来随 的感染， 着抗生素的大量使用， 鲍曼不动杆菌的耐药率不 断上升。2009 年中国 CHINET 鲍曼不动杆菌细菌 ［3 ］ 耐药性监测显示 ， 鲍曼不动杆菌对青霉素类和 对亚胺培 头孢类抗生素的耐药率均高于 53． 3% ， 南和美罗培南的耐药率分别为 54． 8% 和 57． 2% ， 这给治疗和控制感染带来很多困难。 此外， 由于 多重耐药和泛耐药鲍曼不动杆菌菌株的出现， 在 非发酵革兰阴性杆菌中鲍曼不动杆菌成为仅次于 铜绿假 单 胞 菌 引 起 的 医 院 内 感 染 的 重 要 致 病 ［45 ］ 。最近针对细菌感染的噬菌体疗法重新受 菌 到人们的关注。 噬菌体是细菌的病毒， 广泛分布 于自然环境中。鉴于噬菌体对细菌裂解的特异性 和高效性， 相关领域的科研人员和部分生物医药 开展了一系列 公司在噬菌体抗细菌性感染方面， 。由 的基础性研究和噬菌体生物制剂的开发 于噬菌体在细菌性感染 （ 特别是多重耐药性细菌 和超级细菌所致的感染 ） 中可发挥重要作用， 因 ， 此 开展噬菌体及其噬菌体疗法的研究有着重要 的现实意义和潜在的应用价值。
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材料与方法
材料
1． 1． 1
菌株 16 株鲍曼不动杆菌由吉林大学中 日联谊医院检验科提供， 菌株经法国生物梅里埃
32 全自动微生物分析鉴定系统鉴定。 公司 VITEK质控菌株： 大肠埃希菌 ATCC 25922 ， 铜绿假单胞 菌 ATCC 27853 ； 其他菌株： 大肠埃希菌 3 株， 铜绿 假单胞菌、 肺炎克雷伯菌、 普通变形杆菌、 阴沟肠 杆菌、 伤寒沙门菌和福氏痢疾杆菌各 1 株， 由本教 研室鉴定并保存。 1． 1． 2 胰蛋白胨、 酵母浸粉 （ 北京奥博星生物技术有限责任公司 ） ； 营养琼脂 主要试剂与工具酶
ological characteristics to provide early stage's work for the development of biopreparation of phage aiming at bacterial infection． Splittable BAB was isolated and identified using doublelayeragar method． Its size and morphology was observed and examined by electron microscopy using negativestaining． The optimal multiplicity of infection and onestep growth curve of the phages were measured by mixing host bacteria and the phages in different proportions． The extracted genomes of the phages were evaluated on electrophoresis and digested with restriction enzymes． SDSPAGE was employed for analysis of the structural and nonstructural proteins of the phages． And it was successfully isolated three splittable BAB respectively named as ФAb1 ，ФAb2 and ФAb3 ，transmission electron microscopy showed that head of the phages assumed an icosahedra， 50 nm in diameter，having a short tail． The multiplicity of infection of phage 1 was 10 － 2 ，and onestep growth curve revealed that the latent phase was 20 min，and the eruptive 30 min，and ФAb1 was 190 PFU / infected cells． Restriction enzyme electrophoresis showed that the the splitting amount of phage ФAbsize of genome of phage ФAb1 was about 40 kb with a circular doublestranded DNA． SDSPAGE analysis indicated protein electrophoresis of the phage included 7 bands with molecular weight around 29 ～ 116 ku． Phage ФAb1 ，ФAb2 and ФAb3 had very strong splitting virulence against A． baumannii，and it was isolated and identified according its morphology，structure，and phage taxonomy． A． baumannii belonged to the order of Caudovirales，and the family of
要
从污水中分离鉴定鲍曼不动杆菌噬菌体， 并对其生物学特性进行分析， 为开发针对细菌感染的噬菌
体生物制剂提供前期工作 。采用双层琼脂法分离可裂解鲍曼不动杆菌的噬菌体， 通过负染法电镜观察噬菌体 将噬菌体和宿主菌以不同比例混合， 测定噬菌体的最佳感染复数并观察一步生长曲线， 提取噬 的大小和形态， PAGE 分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白 。 成功分离 3 株可裂解鲍 菌体核酸进行酶切电泳分析， 通过 SDS1、 2 和 ФAb3） ， ФAb电镜显示噬菌体的头部呈二十面体， 直径约 50 曼不动杆菌的噬菌体（ 分别命名为 ФAbnm， 1 的最佳感染复数为 10 － 2 ， 有一短尾。噬菌体 ФAb一步生长曲线表明噬菌体在裂解宿主菌时， 潜伏期为 20 min， 1 的基因组大小约 40 kb 爆发期为 30 min， 裂解量为 190 PFU / cell。限制性酶切电泳显示噬菌体 ФAbPAGE 的噬菌体蛋白电泳包括 7 种蛋白， 1、 左右， 为双股环状 DNA。SDS分子量在 29 ～ 116 ku。 噬菌体 ФAb2 和 ФAb3 对鲍曼不动杆菌具有很强的裂解毒性 。根据其形态、 ФAb结构和噬菌体分类法， 鲍曼不动杆菌噬 菌体属于有尾病毒目， 足尾病毒科。 关键词 鲍曼不动杆菌； 噬菌体； 一步生长曲线 Q939． 48 文献标识码 A 文章编号 1005 － 7021 （ 2013 ） 02 － 0017 － 07 中图分类号
（ Dept． of Pathogenobiol． ，Norman Bethune Coll． of Med． ，Jilin Uni． ，Changchun 1Βιβλιοθήκη Baidu0021 ）
Abstract
Bacteriophages specific to Acinetobacter baumannii （ BAB） isolated from sewage was investigated for its bi-
和触酶试验。 根据 GenBank 查询鲍 曼 不 动 杆 菌 16S rRNA 基因序列 （ Accession： Z93435 ） ， 并设计 通过多聚酶链反应， 进一步确认鲍曼不动杆 引物， ACTGGGCGTA菌。设计序列如下： 上游引物： 5'AAGCGTGCGTAGG3' ； 下 游 引 物： 5'TATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCT3' 。扩增目的基因的 PCR 反应条件： 95 ℃ 5 min， 94 ℃ 长度为 436 bp， 40 s， 58 ℃ 40 s， 72 ℃ 1 min， 35 个循环； 72 ℃ 10 min。 1． 2． 2 8］ ， 参照文献［ 取 吉林大学第三医院污水站未处理的污水 1 L， 加 噬菌体的分离与纯化 CaCl2 至终浓度 1 mmol / L， 加入 16 株新鲜培养的 鲍曼不动杆菌宿主菌悬液和 LB 培养基 50 mL， 置 37 ℃ 过夜培养。 次日离心除菌， 取上清用 0． 22 μm 过滤器滤过除菌。分别以 16 株鲍曼不动杆菌 为宿主菌， 与滤过液混合静止 15 min， 加入融化的 0． 7% LB 琼脂（ 50 ℃ ） 并均匀地铺在固体营养琼 37 ℃ 培养 16 ～ 18 h， 观察噬菌斑形成 脂平板上， 挑取单个噬菌斑接种至对 情况。噬菌斑形成时， 应的宿主菌进行扩增， 单个噬菌斑经 3 ～ 5 次反复 纯化后可得到较纯化的噬菌体。 细菌的裂解液经 10 000 × g 离心后， 取上清作连续 10 倍稀释， 取 100 μL 加入 0． 2 mL 相应的宿主菌， 制备噬菌斑 并测定噬菌体滴度 （ PFU / mL ） ， 噬菌体滴度 = 稀 释倍数 × 噬菌斑数 × 10 （ PFU / mL） 。 1． 2． 3 噬菌体的电镜观察 取噬菌体颗粒悬液 20 μL 滴于铜网上， 待其自然沉淀 15 min， 用滤纸 从侧面吸干多余的液体， 加 1 滴 2% 磷钨酸到铜网 上， 染色 10 min， 待铜网干燥后进行电镜观察。 1． 2． 4 噬菌体核酸提取和酶切图谱 在噬菌体
基金项目： 国家自然科学基金（ 81150037 ） 作者简介： 余静丹 女， 硕士研究生。研究方向为噬菌体的生物学和分子遗传学。 * 通讯作者。男， 85619574 ， Email： sunyb@ jlu． edu． cn 教授。研究方向为噬菌体疗法在耐药性细菌中的应用 。Tel： 04310828 ； 修回日期： 20121225 收稿日期： 2012-